红树莓籽中活性物质提取工艺优化

,, ,,*

(1.东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨 150040; 2.黑龙江童医儿童生物制药有限公司,黑龙江哈尔滨 150040)

红树莓(RubusideausL.)属蔷薇科悬钩子属,俗名覆盆子、托盘等。红树莓中含有大量的活性物质,如多酚、黄酮、原花青素等[1-2]。其活性成分可用于抗癌、抗肿瘤等重症治疗[3-4]。红树莓籽作为红树莓的副产物,其营养物质丰富[5-7],含有人体必需的不饱和脂肪酸[8]和丰富的抗氧化活性物质,具有积极的生理功效[9]。

赵金璐等[10]通过动物实验研究得出树莓提取物能抑制肝癌细胞PCNA的表达,起到抑制其增殖的作用。李萌萌[11]等发现红树莓籽黄酮具有较高的抗氧化活性,能够清除人体中超氧离子自由基,具有抗癌细胞增殖作用,同时还具有强化免疫系统功能、降血压等功效[12-13]。目前对红树莓籽原花青素的功能研究较少,仅在分离和纯化上有所研究。张佰清等[14-15]通过大孔吸附树脂分离出较高纯度的原花青素并测定了从中分离出的三条色谱带的平均聚合度。在加工过程中,大量的树莓籽作为副产品或生产废物,因缺乏有效的提取工艺而没有得到开发和利用。

本实验为阐明红树莓籽中多酚、黄酮、原花青素提取的影响因素,从乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比、pH等方面进行研究,并通过优化获得最佳提取条件,以期为红树莓果籽的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红树莓(秋福) 尚志市采摘后-10 ℃冷冻保存;福林酚 北京新天创高科技有限公司;香草醛 天津市致远化学试剂有限公司;儿茶素、没食子酸、芦丁标准品 上海源叶生物科技有限公司;亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、浓硫酸、浓盐酸、无水乙醇 均为市售分析纯。

DL-6M高速离心机 湖南星科科学仪器有限公司;RE-2000A旋转蒸发仪 巩义市予华仪器有限责任公司;722可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;RT502分析天平 常熟市意欧仪器仪表有限公司;JYL-C23 九阳料理机 九阳股份有限公司;P70F23P-G5(S0) 微波炉 广东格兰仕微波生活电器制造有限公司;ND7-2L 球磨机 南京南大天尊电子有限公司;SHZ-C水浴恒温振荡器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;DK-8D电热恒温水槽 巩义市予华仪器有限责任公司;DHG-9030A电热恒温鼓风干燥箱 巩义市予华仪器有限责任公司;PHS-3E型PH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;KQ-300DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红树莓籽活性物质的提取工艺

1.2.1.1 红树莓籽脱脂粉的制备 取1 kg于-10 ℃中保存的红树莓冻果于微波炉中(解冻挡位)解冻6 min,解冻后的红树莓果用榨汁机粉碎成匀浆状。榨汁后的树莓果浆用双层纱布过滤取籽,之后将红树莓籽放于80 ℃烘箱中烘干2 h。烘干后的树莓籽通过球磨机进行磨粉,过120目筛。使用正己烷作为溶剂在40 ℃条件下超声脱脂20 min后抽滤得到红树莓籽脱脂粉。

1.2.1.2 红树莓籽脱脂粉活性物质的提取 使用乙醇作为提取溶剂,在控制一定的乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比、pH 5个条件下对红树莓籽中活性成分进行提取,提取液在4000 r/min,20 ℃的条件下离心10 min,之后在45 ℃,0.1 MPa的条件下真空浓缩30 min除去溶剂。用蒸馏水定容至100 mL置于-10 ℃环境中冷藏备用。

1.2.2 乙醇提取法的单因素实验设计 按照1.2.1.2的方法,以多酚,黄酮,原花青素含量为指标,在pH为4,50 ℃的条件下,以料液比1∶35 (g/mL)的配比提取3 h,探讨不同乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%)对红树莓籽活性物质提取含量的影响;使用60%乙醇进行提取,在pH为4的条件下,以料液比1∶35 (g/mL)的配比提取,探讨不同提取时间(1、2、3、4、5 h)对红树莓籽活性物质提取含量的影响;使用60%乙醇进行提取,在pH为4的条件下,以料液比1∶35 (g/mL)的配比提取3 h,探讨不同提取温度(30、40、50、60、70 ℃)对红树莓籽活性物质提取含量的影响;使用60%乙醇进行提取,在pH为4,50 ℃的条件下提取3 h,探讨不同料液比(1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55)对红树莓籽活性物质提取含量的影响;使用60%乙醇进行提取,在50 ℃的条件下,以料液比1∶35 (g/mL)的配比提取3 h,探讨不同pH(2、3、4、5、6)对红树莓籽活性物质提取含量的影响。

1.2.3 响应面优化试验设计 根据Box-Behnken实验设计原理进行四因素三水平实验设计,利用Design-Expert 8.0软件设计,以多酚提取含量为指标,进行数据拟合优化红树莓籽活性物质提取工艺。在单因素试验的基础上,自变量的实验水平分别以-1、0、1进行编码,共设计29个实验点。响应面试验因素及水平如表1所示。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 红树莓籽活性物质提取含量的测定

1.2.4.1 红树莓籽中多酚提取含量的测定 采用福林酚法[16]测定红树莓籽多酚提取含量。以没食子酸为标准品,没食子酸浓度(0、0.02、0.04、0.06、0.08、1.00 mg/mL)为横坐标,765 nm处吸光度为纵坐标。其线性回归方程为y=8.8503x+0.0111(R2=0.9991)。红树莓籽多酚提取含量以每克脱脂干红树莓籽粉中总酚的毫克数表示。

1.2.4.2 红树莓籽中黄酮提取含量的测定 采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[17]测定红树莓籽总黄酮提取含量。以芦丁为标准品,芦丁浓度(0、0.02、0.04、0.06、0.08、1.00 mg/mL)为横坐标,510 nm处吸光值为纵坐标。其线性回归方程为y=1.0229x+0.0003(R2=0.9992)。红树莓籽黄酮提取含量以每克脱脂干红树莓籽粉中黄酮的克毫数表示。

1.2.4.3 红树莓籽中原花青素提取含量的测定 采用香草醛-硫酸法[18]测定红树莓籽原花青素提取含量。以儿茶素为标准品,儿茶素浓度(0、0.02、0.04、0.06、0.08、1.00 mg/mL)为横坐标,500 nm处的吸光值为纵坐标。其线性回归方程为y=1.6957x-0.0010(R2=0.9994)。红树莓籽原花青素提取含量以每克脱脂干红树莓籽粉中原花青素的毫克数表示。

1.2.4.4 红树莓籽中多酚,黄酮,原花青素计算公式 总酚/总黄酮/原花青素提取量(mg/g)=(C×V×n)/m;式中:C代表根据回归方程计算得到的质量浓度(mg/mL),V代表提取液总体积(mL),n代表稀释倍数,m代表脱脂干红树莓籽粉末的质量(g)。

1.3 数据处理与分析

采用Excel、Origin Pro 8.1、Design-Expert 8.0软件对数据进行处理与分析。每组实验重复三次,实验数据以x±s表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对红树莓籽中活性物质提取量的影响 如图1所示,当乙醇浓度在40%～60%时,多酚的提取含量随乙醇浓度增加而增加,当乙醇浓度为60%时,多酚的提取含量达到最大值为(31.91±0.52) mg/g。此时黄酮和原花青素的提取含量也达到最大,黄酮的提取含量为(15.22±0.43) mg/g,原花青素为(18.98±0.39) mg/g;当乙醇浓度高于60%,多酚的提取含量开始下降。乙醇浓度对黄酮的提取含量影响与李萌萌等[6]实验结果相似,对原花青素的影响与吴迪[12]的实验结果相似。这可能是乙醇浓度增大了其他物质的溶出从而抑制了还原性物质的提取[19]。当乙醇浓度较高时,色素、醇溶性杂质等物质溶解,这些物质影响了活性物质与醇结合的能力,同时,高浓度的乙醇会降低细胞的通透性,从而抑制活性物质的析出,使其提取含量降低[20]。综合上述情况,最佳乙醇浓度范围选择40%～60%。

图1 乙醇浓度对红树莓籽活性物质提取量的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.1.2 提取时间对红树莓籽中活性物质提取量的影响 如图2所示,三种活性物质的提取含量随提取时间的增长均为先上升后下降的趋势。当提取时间为4 h时,多酚和原花青素的提取含量都达到最大值分别为35.13、20.92 mg/g;黄酮的提取含量在3 h时达到最大为15.30 mg/g;综合上述情况,最佳提取时间范围选择3～5 h。三种活性物质的提取含量随提取时间变化的原因是随着提取时间的延长,活性物质的溶出率随之增加,但当提取时间过长时,多酚类物质随之溶解,导致活性物质提取含量降低。

图2 提取时间对红树莓籽活性物质提取量的影响Fig.2 Effects of extraction time on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.1.3 提取温度对红树莓籽中活性物质提取量的影响 如图3所示,随着提取温度的升高,多酚的提取含量先增加后减少;当提取温度为50 ℃时,多酚与黄酮的提取含量达到最大值分别为30.83、15.34 mg/g。原花青素在实验提取温度范围内随提取温度升高提取含量降低,30 ℃时提取含量最大为19.45 mg/g。综合上述情况,选择最佳提取温度范围为40～60 ℃。多酚与黄酮提取含量变化原因是当提取温度升高时,分子加速运动,导致树莓籽中多酚、黄酮等物质结合的氢键容易断裂,从而使他们的析出率增加,扩散速度加快,最终使其提取含量增加。同时,将提取温度继续升高,当超过50 ℃时,多酚与黄酮等物质结合的氢键断裂后存在不稳定,过高的提取温度也可能会导致析出的多酚和黄酮被氧化或降解等一系列不可逆反应,使析出的活性物质有所损失,从而导致提取含量降低[21]。

图3 提取温度对红树莓籽活性物质提取量的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.1.4 料液比对红树莓籽中活性物质提取量影响 如图4所示,随着料液比的升高,多酚的提取含量先增加后减少,当料液比到达1∶45 (g/mL)时,多酚的提取含量达到最大值为35.65 mg/g。当料液比为1∶15～1∶35 (g/mL)时,黄酮与原花青素的提取含量随之升高之后趋于平稳。因此,选择最佳料液比范围为1∶35～1∶55 (g/mL)。料液比对活性物质提取含量的影响与李萌萌等[6]的实验结果相似,黄酮提取含量均在料液比为1∶35 (g/mL)时达到最大。可能是随着料液比的增大,通过提高溶剂用量,可以增加质量浓度梯度,活性物质从红树莓籽组织内向外扩散过程中,固液间质量浓度梯度是提取物发生转移的动力,浓度梯度和扩散速率升高,有利于活性物质的溶出,导致活性物质提取含量的提高;但当料液比达到某一极限后,再提高料液比收效不大或抑制活性物质的渗出。

图4 料液比对红树莓籽活性物质提取量的影响Fig.4 Effects of ratio of solid to solvent on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.1.5 pH对红树莓籽中活性物质提取量的影响 如图5所示,pH对多酚和原花青素的提取含量影响不大,多酚的提取含量在pH为2和6时相对较高，在pH=6时最大为35.18 mg/g。黄酮和原花青素的提取含量随pH的增大呈现先上升后下降的趋势,提取含量在pH=3达到最大为17.19、21.28 mg/g。pH对多酚的提取含量影响与旷慧等[22]实验结果相似。可能原因是强酸性条件破坏了化学键,使结合力强的多酚被提取出来;或破坏了低聚/多聚酚类物质间的结合力,使单体多酚游离出来;或者可能是在pH=4.5～5.0多酚氧化酶活性较高,分解了多酚类物质从而导致多酚的提取含量稍有下降[23]。

图5 pH对红树莓籽活性物质提取量的影响Fig.5 Effects of pH on the extraction efficiency of polyphenols,flavonoids and proanthocyanidins

2.2 响应面优化提取工艺

响应面试验及结果如表2所示。

利用Design-Expert 8.0对表3数据进行多元回归拟合,获得多酚提取含量(Y)对自变量料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)、乙醇浓度(D)的二元多项回归模拟方程:

Y=38.03+1.21A+0.70B-0.32C-0.14D-1.17AB-0.63AC-0.60AD-0.34BC-0.36BD-0.071CD-2.85A2-0.63B2-0.80C2-1.53D2

Box-Benhnken中心组合实验设计及结果、方差分析分别见表2、表3。

表2 Box-Benhnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回归模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of the regression model

图6 因素交互作用对多酚提取含量响应面图Fig.6 Response surface plots for the effects of different factors on the extraction rate of polyphenols

利用Design-Expert 8.0分析得到最佳条件工艺为:料液比1∶50.37 (g/mL)、提取温度50.61 ℃、提取时间3.48 h、乙醇浓度57.22%。考虑实际情况,将以上条件校正为:料液比1∶50 (g/mL)、提取温度51 ℃、提取时间3.5 h、乙醇浓度57%。根据响应面法优化条件进行验证实验,最终得到多酚提取含量Y=(38.32±0.25) mg/g,与预测值38.4761 mg/g相差0.41%,因此可确定其为最佳工艺条件,此时,测得黄酮与原花青素的提取含量分别为(17.50±0.14)和(19.71±0.27) mg/g。

3 结论

红树莓籽中活性物质的最佳提取工艺为:料液比1∶50 (g/mL)、提取温度51 ℃、提取时间3.5 h、乙醇体积分数57%、pH=3。在此工艺条件多酚的提取含量为(38.32±0.25) mg/g,黄酮提取含量为(17.50±0.14) mg/g,原花青素提取含量为(19.71±0.27) mg/g。本实验通过响应面法得到了红树莓籽中活性物质的最佳提取工艺,为红树莓果籽的综合利用提供理论依据。