响应面法优化水酶法提取番木瓜籽蛋白质工艺

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(岭南师范学院化学化工学院,广东湛江 524048)

番木瓜(CaricapapayaL.),属番木瓜科,番木瓜属,又名木瓜、万寿果等。番木瓜属药食兼用水果,含有糖类、木瓜蛋白酶、黄酮类、类胡萝卜素、多酚类、萜烯类和生物碱等多种营养成分和植物化学物质,具有抗肿瘤、增强免疫调节和抗癌等作用[1-4]。产自热带和亚热带地区,在我国主要在广东、海南、广西等地区种植。因其丰富的营养价值和医疗价值,消费者对于其需求有增无减[5]。番木瓜除可以鲜食外,还可加工成果酱和果汁等[6-8]。番木瓜籽是番木瓜鲜食或加工成相关产品后的副产物,通常将其作为废弃物丢掉,不仅造成环境污染,而且浪费资源。目前,有关番木瓜籽的活性成分如硫代葡萄糖苷[9]、异硫氰酸酯类物质[10]、多酚[11]等都有相关报道,番木瓜籽粗提取也有很多功能特性,如抗氧化活性等[12-13],番木瓜籽中油脂的研究也有很多文献报道[14-19]。

植物蛋白质的提取目前主要为碱溶酸沉法,反胶束萃取技术在植物蛋白质的提取中也有相关的报道[20]。王标诗等[21]报道了碱溶酸沉法提取番木瓜籽中蛋白质并对其功能性质进行了探讨;马若影等[22]也研究了番木瓜籽蛋白质超声辅助提取以及超声协同微波辅助提取工艺及其性质进行了研究;Parniakov等[23]报道了脉冲电能辅助水提取番木瓜籽中蛋白质、多酚及碳水化合物等研究,但是通过这些研究发现番木瓜籽蛋白质的提取率相对还不是很高,提取过程中也不能回收其他成分。目前,水酶法已在多种植物种籽中都得到了应用,水酶法在提取蛋白质的同时可以有效的回收油料中其他营养物质[24],如油脂等,具有广阔的市场前景。番木瓜籽中还含有一定量的蛋白质,可作为植物蛋白质的良好来源,但是目前对于番木瓜籽中的蛋白质的研究鲜有报道。有关水酶法提取番木瓜籽蛋白质还未见报道。

为此,本论文以番木瓜籽为研究对象,通过响应面法优化了水酶法提取番木瓜籽中蛋白质的工艺条件,以期为番木瓜的综合开发高值化利用提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

番木瓜(九成熟) 购于当地水果市场,产地为湛江;中性蛋白酶(20万U/g,pH7.0～7.8,40 ℃) 阿拉丁试剂(上海)有限公司;碱性蛋白酶(20万U/g,pH8.5～10.5,50～60 ℃) 阿拉丁试剂(上海)有限公司;木瓜蛋白酶(20万U/g,pH6.0～7.0,55～65 ℃) 阿拉丁试剂(上海)有限公司;纤维素酶(20万U/g,pH4～5.5,50～60 ℃) 阿拉丁试剂(上海)有限公司;其他化学试剂 均为分析纯。

DFY-800摇摆式高速万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司;DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;KDN-103F自动定氮仪 上海纤检仪器有限公司;HC-3518高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;BCD-256KFA冰箱 青岛海尔股份有限公司;FA1004N电子天平 上海精密科学仪器有限公司;pHS-3C精密pH计 上海雷磁仪器厂;HYP-1004消化炉 上海纤检仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 番木瓜切开取籽,经清洗干净后在60 ℃恒温干燥箱中干燥约10 h,用粉碎机粉碎并60目过筛,备用。

1.2.2 水酶法提取番木瓜籽蛋白质 称取一定量的番木瓜籽于干净的烧杯中,按照一定的料液比加入水,按一定的加酶量加入某种酶,在一定的温度、一定的pH下水解一段时间,水解后于90 ℃条件下处理10 min进行灭酶,然后在4000 r/min离心30 min,滤渣用清水清洗后再在4000 r/min的离心机下常温离心30 min,合并滤液和清洗液,去掉上层油脂层后得到酶解液,用于蛋白质提取率的测定。

1.2.3 酶种类的选择 称取一定量的番木瓜籽粉到干净烧杯中,按料液比1∶15 (g/mL)加水,分别添加中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶,按1.5%的加酶量在各种酶的最适温度和pH条件下(中性蛋白酶pH7.5,40 ℃;碱性蛋白酶pH9.5,55 ℃;木瓜蛋白酶pH6.5,60 ℃;纤维素酶pH5.0,55 ℃)酶解3 h,90 ℃条件下处理10 min进行灭酶,然后在4000 r/min常温离心30 min,测定酶解液蛋白质含量。空白试验：自然pH和常温下，不加蛋白酶处理，其他相同。以蛋白质提取率为指标评价各种酶的提取效果。

1.2.4 单因素实验 在筛选出最佳酶的基础上,按照1.2.2的方法,以蛋白质提取率为指标,在pH为7.5,40 ℃下,以1.5%的用酶量添加木瓜蛋白酶酶解3 h,探讨不同料液比(1∶11、1∶13、1∶15、1∶17、1∶19、1∶21)对番木瓜籽蛋白质提取率的影响;以1.5%的用酶量添加木瓜蛋白酶,在pH为7.5下,酶解3 h,探讨不同温度(30、35、40、45、50、55、60 ℃)对番木瓜籽蛋白质提取率的影响;在pH为7.5、40 ℃下,酶解3 h,探讨木瓜蛋白酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)对番木瓜籽蛋白质提取率的影响;以1.5%的用酶量添加木瓜蛋白酶,在pH为7.5、40 ℃下进行酶解,探讨酶解时间(2、3、4、5、6 h)对番木瓜籽蛋白质提取率的影响;以1.5%的用酶量添加木瓜蛋白酶,在40 ℃下酶解3 h,探讨不同pH(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)对番木瓜籽蛋白质提取率的影响。

1.2.5 响应面试验 在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken试验设计优化木瓜蛋白酶在料液比为1∶19下提取番木瓜籽蛋白质的工艺参数。以pH、酶添加量、温度、时间为影响因素,以蛋白质提取率为试验指标,响应面试验设计因素与水平如表1所示。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.6 蛋白质提取率的测定 蛋白质测定方法为凯氏定氮法,参考GB 5009.5-2010。

蛋白质提取率(%)=酶解液中蛋白质的含量(g)/样品质量(g)×样品中粗蛋白的含量(%)×100

1.3 数据分析

以上实验均重复测量3次,实验结果以平均值±标准偏差的形式表示,数据之间的显著性差异采用SPSS软件进行分析。响应面法采用Design Expert软件中的Box-Behnken进行设计,数据分析采用Design Expert软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 样品中蛋白质含量的测定结果

经凯氏定氮法分析测定可知,番木瓜籽中的粗蛋白质含量为26.21%±0.15%。据文献报道,邓楚津等[25]研究结果表明番木瓜籽中粗蛋白质的含量为24.91%,Marfo等[26]研究结果表明番木瓜籽中蛋白质含量为27.8%,Briones-Labarca等[27]研究结果表明番木瓜籽(样品湿度为3.5%时)中蛋白质含量为31.84%±0.03%,去除水分约为28.34%,这些结果均在24%～29%,本试验的结果在此范围内,产生的差别的原因可能由于番木瓜来源、品种和成熟度等不同所致。

2.2 酶的选择

各种酶对蛋白质提取率影响结果如图1所示。水酶法提取过程中酶的选择至关重要。从图1可看出,在各种酶的最适条件下添加木瓜蛋白酶时,蛋白质的提取率高于其他酶,而添加中性蛋白酶与碱性蛋白酶时,蛋白质的提取率非常接近,没有显著性差异(p<0.05),他们与木瓜蛋白酶和纤维素酶之间差异显著(p<0.05)。木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶的最适pH均远离番木瓜籽蛋白的等电点(约3.3),不同程度上提高了蛋白质在体系中的溶解度,从而易于蛋白酶的作用[24],相对而言，木瓜蛋白酶效果更好。而纤维素酶只对细胞壁具有破坏作用,酶不能完全接触到蛋白质等物质,提取率较低,由于木瓜蛋白酶也是常用的水解酶之一,因此选择木瓜蛋白酶作为最佳用酶。

图1 酶的种类对番木瓜籽蛋白质提取的影响Fig.1 Effects of different enzymes on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3 单因素实验

2.3.1 料液比对番木瓜蛋白质提取率的影响 料液比对蛋白质提取率的影响结果如图2所示。由图2可知,总体上随着料液比的增大,番木瓜蛋白质的提取率不断增大;当料液比在1∶11～1∶15时,番木瓜蛋白质提取率增加较快;料液比低于1∶15时,提取率相对较小,这是因为料液比低时,体系中水量有限,可以溶解的蛋白质量也有限[24];之后随着料液比的增加提取率增加相对较为缓慢,达到1∶19后基本上不增加,可能由于溶剂过多,对蛋白质有一定的稀释作用,故选择以1∶19做为最佳料液比。

图2 料液比对番木瓜籽蛋白质提取率的影响Fig.2 Effects of material/solvent ratio on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3.2 温度对番木瓜籽蛋白质提取率的影响 温度对蛋白质提取率的影响结果如图3所示。由图3可知,在30～50 ℃时,随着温度的提高,番木瓜蛋白质的提取率增大;当温度达到50 ℃时,提取率达到最大值80.63%;当温度超过50 ℃后,提取率随着温度的提升而下降,这是由于木瓜蛋白酶在超过50 ℃时使其偏离其最适温度,导致提取率降低。因此选择50 ℃作为酶解温度。

图3 温度对番木瓜籽蛋白质提取率的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3.3 酶添加量对番木瓜籽蛋白质提取率的影响 酶添加量对蛋白质提取率的影响结果如图4所示。由图4可知,在酶添加量为1.5%～2.0%之间时,提取率增大速度最快,提取率最大为84.70%,当用酶量超过2.0%时,提取率开始缓慢下降,进一步增加酶用量,提取率不会提高,这可能是因为蛋白质受到酶的过度水解,空间结构受到破坏[28]。再者,考虑到酶的价格较高,酶用量过高加大产品的成本,因此选择最佳加酶量为2.0%。

图4 酶添加量对番木瓜籽蛋白质提取的影响Fig.4 Effects of enzyme amount on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3.4 酶解时间对番木瓜籽蛋白质提取率的影响 酶解时间对蛋白质提取率的影响结果如图5所示。由图5可知,在提取时间为2～3 h时,蛋白质提取率增加较快,之后3～4 h时增加过缓,4 h后增加非常缓慢,到5 h达到最大值83.38%,之后反而略有降低,这是因为底物随酶解时间的延长而不断减少,酶解产物会对酶解反应起到一定的抑制作用[29]。综合考虑后,选择5 h为最佳酶解时间。

图5 酶解时间对番木瓜籽蛋白质提取的影响Fig.5 Effects of time on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3.5 酶解pH对番木瓜籽蛋白质提取率的影响 酶解pH对蛋白质提取率影响结果如图6所示。由图6可知,pH从6.5增加到7.0,蛋白质提取率也随之增大,当pH为7时,有最大值84.71%,当pH从7.0增加到8.0时,提取率明显降低,这是由于在pH为7时接近于此条件下的最适pH,此时酶活性最高,酶解蛋白的能力也最强,因此选择最佳pH为7。

图6 pH对番木瓜籽蛋白质提取率影响Fig.6 Effects of pH on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.4 响应面分析法优化水酶法提取番木瓜籽蛋白质的工艺

2.4.1 响应面试验结果与分析 在单因素试验的基础上,以pH、加酶量、温度、时间为影响因素变量,以蛋白质提取率为试验指标,通过Box-Behnken试验设计方案按表1进行四因素三水平设计试验,结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Experimental design and resultsfor response surface analysis

对表2的数据在Design Expert上进行分析得到拟合方程如下:

由Design Expert软件进行回归及方差分析结果如表3所示。对数学模型进行方差分析,结果表明模型的总回归也极显著(p<0.01),其决定系数R2为0.9975,这说明该模型在试验范围内拟合度较高。二次回归方程可用于对试验进行可靠分析和预测[29]。对数学模型进行失拟检验,显示其失拟性呈不显著(p>0.05),说明该模型在试验范围内拟合度也是比较高的。对该数学模型的回归系数检验可知:四个因素对试验的影响极显著(p<0.01),而交互项中的交互影响均为极显著(p<0.01)。通过F值的大小判断可得各个因素对番木瓜籽蛋白质提取率的影响力为X3>X4>X2>X1,即温度>酶解时间>pH>酶添加量。

表3 Design Expert软件回归模型和方差分析结果Table 3 Results of regression and variance analysis by Design Expert software

2.4.2 响应面分析与最优条件的确定 三维响应面和等高线图是回归方程的图形表现形式,可用来表示测试变量和响应值与各变量水平之间的相互作用关系。通过图7～图12中6组响应面及等高线的形状来分析酶添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间4个主要因素间的交互作用对番木瓜籽蛋白质提取率的影响,结果发现,响应面图呈现先升高后降低的趋势,酶添加量和pH(X1X2)、酶添加量和温度(X1X3)交互作用较其它交互作用更强,这与方差分析结果基本一致。

从图7～图12可看出,三维图总体趋势为向上凸起,说明该数学模型具有最大值。利用Design-Expert软件对试验数据进一步分析,并对拟合的回归方程进行计算,预测水酶法提取番木瓜籽蛋白质的最佳工艺条件当X1=2.04,X2=6.97,X3=49.22,X4=5.38时,即酶添加量为2.04%,pH为6.97,温度为49.22 ℃,酶解时间为5.38 h时,理论提取率最大为85.03%。由于实验条件限制,将该条件修订为酶添加量为2.0%,pH为7.0,温度为49 ℃,酶解时间为5.0 h时,对该条件进行验证试验,实际测得的结果为84.96%±0.13%,软件在该点的估计值为84.94%,与预测值相比,误差仅为0.08%,接近预测值,表明在该试验模型下得到的最佳工艺条件具有较高的可靠性,可以用于预测水酶法提取番木瓜籽蛋白质的工艺条件。

图7 酶添加量和pH对蛋白质提取率的影响响应面和等高值图Fig.7 Response surface and contour of effect of enzymes amount and pH on the extraction rate of protein from papaya seed

图8 温度和酶添加量对蛋白质提取率的影响响应面和等高值图Fig.8 Response surface and contour of effect of enzymes amount and temperature on the extraction rate of protein from the papaya seed

图9 时间和酶添加量对蛋白质提取率的影响响应面和等高值图Fig.9 Response surface and contour of effect of enzymes amount and extraction time on the extraction rate of protein from the papaya seed

图10 温度和pH对蛋白质提取率的影响响应面和等高值图Fig.10 Response surface and contour of effect of temperature and pH on the extraction rate of protein from the papaya seed

图11 时间和pH对蛋白质提取率的影响响应面和等高值图Fig.11 Response surface and contour of effect of time and pH on the extraction rate of protein from the papaya seed

图12 温度和时间对蛋白质提取率的影响响应面和等高值图Fig.12 Response surface and contour of effect of time and temperature on the extraction rate of protein from the papaya seed

3 结论

本试验在单因素试验基础上,利用响应面分析法优化了水酶法提取番木瓜籽蛋白质的工艺条件。最终得出最佳工艺条件为:使用木瓜蛋白酶在料液比为1∶19,酶添加量为2.0%,pH为7.0,温度为49 ℃,酶解时间为5 h,此时番木瓜籽蛋白质的提取率最高为84.96%±0.13%。四个因素对番木瓜籽蛋白质提取率的影响为温度>酶解时间>pH>酶添加量。对番木瓜籽的高值化综合开发利用,不仅有利于解决废弃物造成的环境污染问题,还将带来良好的经济效益和社会效益。