胡椒单萜类化合物对单增李斯特菌抑菌机理的研究

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(海南大学食品学院,海南海口 570228)

目前在食品保鲜方面,市场上占主导地位的是化学抑菌剂,但随着医学、毒理学和生物学研究的不断深入,发现大多化学抑菌剂对人体都有不同程度的伤害。与之相比,天然抑菌剂的毒性远远低于化学保鲜剂的毒性,且抑菌效果显著。胡椒是我国卫生部第一批公布的药食兼用的植物材料之一,属于多年生常绿大型藤本植物[1]。胡椒中挥发油含量4.5%以上,所含成分大多为胡椒单萜类化合物(如柠檬烯等),可抑制微生物生长,此外,胡椒碱和胡椒脂碱是构成胡椒辛辣风味的植物碱[2]。

胡椒挥发油对动物和植物病菌、腐败菌均有抑制效果,椒醇提取物对常见食品污染菌有较强的抑制作用[3]。Pradhan等[4]研究了青胡椒提取物的抑菌作用,发现该物质对鼠伤沙门氏菌、葡萄球菌和大肠杆菌均有抑制作用。目前,大多研究仅讨论了天然抑菌剂的宏观抑菌特性,但具体到胡椒中何种成分起作用以及对细菌的作用靶点却鲜有报道。

蛋白质组学是研究和探索蛋白质组的一门新兴学科,是功能基因组学的重要组成部分。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)作为一种现代的蛋白组学技术,几乎可以对任何蛋白样品进行定量分析,具有高定量精度的特点,目前已广泛应用于定量蛋白质组学领域[5]。本文基于蛋白组学技术,研究胡椒单萜类化合物对单增李斯特菌(L.monocytogenes)的抑菌机制,通过分析单增李斯特菌的差异蛋白、呼吸链复合体以及三磷酸腺苷酶(ATP酶)等指标,根据同源建模与分子对接技术探索其作用靶点,为进一步明确胡椒单萜类化合物的抑菌机制提供基础和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

成熟胡椒果 海南省文昌市;L.monocytogenes中国科学院微生物研究所;胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、碘乙酰胺(IAM)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、胰蛋白酶(Trypsin,potency≥2500 units/mg)和牛血清蛋白(纯度≥98%) 海南海道森科技有限公司;BCA蛋白定量试剂盒、质谱级胰蛋白酶、iTRAQ 4-plex标记试剂盒、低分子量预览蛋白质Marker 美国Sigma公司。

TP-313电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯萃取头 美国Supelco;Vaco2-Ⅱ冷冻干燥系统 德国ZIRBUS;B-220旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;超声波细胞破碎仪 美国SONICS;GC-6890气相色谱仪 滕州市滕海分析仪器有限公司;强阳离子交换色谱柱(SCX) 上海楚定分析仪器有限公司;Triple TOF5600液相串联质谱(LC-MS/MS) 美国Applied Biosystem。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 将采集的成熟胡椒果500 g置于阳光下暴晒3～4 d,液氮粉碎(2800 r/min)后冷冻(-40 ℃)干燥38 h,保鲜袋密封,4 ℃条件下保存备用。

1.2.2 胡椒单萜类化合物的提取 参考王延辉等[6]的方法,采用蒸馏萃取提取(SDE)的方法,提取胡椒中的单萜类化合物。SDE条件:取50 g胡椒粉末置于500 mL的圆底烧瓶中,加入200 mL超纯水和少量玻璃珠。接收端装90 mL沸程90～120 ℃石油醚,85 ℃恒温水浴提取60 min。萃取后上层有机相过50 g无水硫酸钠柱,滤液经旋转蒸发仪浓缩后便制得胡椒单萜类化合物。

1.2.3 菌种活化 吸取5 μL保存于-80 ℃冻存的L.monocytogenes冻存液,接种到装有5 mL灭菌TSB肉汤培养基中。用试管塞塞好试管,并用报纸包好试管管口,将试管倾斜放置于37 ℃恒温振荡培养箱中,将恒温振荡器速度调节至80 r/min,振荡培养16 h后,在TSB肉汤培养基中传代三次,之后采取平板划线法纯化菌种,接种环接种于琼脂板上并倒扣。将平板倒放在37 ℃恒温培养箱中培养16～24 h后,挑取单个菌落,在无菌条件下接种到TSB肉汤培养基的试管中,按照上述所说的方法再一次培养12 h。用灭菌过的TSB肉汤培养基将菌液进行稀释,使溶液在600 nm波长处的吸光值为0.1,此时菌液中的菌落个数为5×108cfu/mL,菌液置于4 ℃保存备用。

1.2.4L.monocytogenes生长曲线的测定 参考Qiu等[7]的方法,取40 mL菌液移入EP管中,实验组(SA)加入0.3 g胡椒单萜类化合物,同时设立空白对照组(CK)。EP管置于37 ℃的恒温振荡摇床中培养,在24 h内每隔4 h移出10 μL菌液,滴在琼脂培养基上测定L.monocytogenes菌落数。

1.2.5 胡椒单萜类化合物对Na+-K+-ATPase及Ca2+-ATPase活力的影响 参考陆海霞等[8]方法,将CK组与SA组用无菌生理盐水制备成106～107cfu/mL的菌悬液,经超声(25 W,10 min)破碎。采用超微量Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase试剂盒测定Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性。菌悬液在24 h内每隔4 h测定一次酶活力,酶活力单位定义为每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷的量,单位U/mg。

1.2.6 iTRAQ法定量蛋白质 取50 mL菌液移入EP管中,SA加入0.3 g胡椒单萜类化合物,同时设立CK,4 ℃下冷藏。将SA与CK用无菌生理盐水制备成106～107cfu/mL的菌悬液,进行超声(25 W,10 min)破碎。参考周业丰[6]的方法提取菌液中的蛋白,并对蛋白样品依次进行还原烷基化处理、Trypsin酶解、iTRAQ 4-plex标记肽段、标记后的肽段混合、SCX进行预分离、LC-MS/MS分析采集数据。用数据库(27029sequences)对蛋白质序列进行鉴定,Mascot进行数据库搜索,依据蛋白质丰度水平,当差异倍数大于1.2 倍,且经统计检验其P-value值小于0.05时,视为SA与CK之间的表达上调或下调差异蛋白。

1.2.7 呼吸链复合体活性的测定 取50 mL菌液移入EP管中,SA加入0.3 g胡椒单萜类化合物,同时设立CK,4 ℃下冷藏。在冷藏的第8 h取出菌液,将菌液在低压缓冲液中水浴与冰箱中反复冻融3次(冻5 h、溶1 h),使得呼吸链复合体能够尽可能释放。参考Allen等[9]的方法测定呼吸链复合体(MRCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)的活性。

1.2.8 同源模建与分子对接 选取蛋白组学中与呼吸链相关的蛋白作为受体,胡椒单萜类化合物作为配体。使用Swiss-Model软件,提交蛋白的序列数据,然后对每一条氨基酸序列在数据库中寻找各自的序列同源性较高的同源蛋白,使用这些已知晶体结构的蛋白质作为模板。根据模板蛋白序列质量、与目标蛋白的序列相似性以及序列覆盖度等指标,选择同源性最好的三种蛋白质结构作为目标蛋白的模板,构建其三维结构模型。分子对接过程中,在找到受体和与之结合的配体的三维结构模型的基础上,通过计算寻找到靶标分子的活性结合位点,并将配体放置在活性结合位点处。通过不断优化配体分子的构象与结合方式,模拟受体与配体分子结合的过程,预测其可能的结合方式,通过打分函数从结果中筛选出与受体结合后最接近天然结合构象的配体[10]。

1.2.9 统计分析 每组试验做3次重复实验。方差分析:SPSS 19.0软件对数据进行T检验;图形制作:Origin 8.0。;数据库:27029sequences;蛋白质鉴定软件:Mascot搜索。

2 结果与分析

2.1 添加胡椒单萜类化合物对单增李斯特菌落数的影响

图1为添加浓度30 mg/mL胡椒单萜类化合物后0～24 h内L.monocytogene的生长曲线,由图1可知,CKL.monocytogene菌落数不断增加,SAL.monocytogenes菌落数呈先增后减的趋势。在培养4～16 hL.monocytogene菌落数显著降低(p<0.05),8～24 h SA中L.monocytogene菌落数显著低于CK(p<0.05)。胡椒提取物对来自于口腔中的细菌菌株具有较强的抑制作用,20 mg/mL的胡椒石油醚相提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等抑菌效果良好[11-12]。

图1 L. monocytogenes生长曲线Fig.1 L. monocytogenes growth curve

2.2 添加胡椒单萜类化合物对L. monocytogenes ATP酶活力的影响

ATP酶是一类能将三磷酸腺苷(ATP)催化水解为二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根离子的酶,其中Na+-K+-ATPase是镶嵌在细胞膜磷脂双分子层中的一种蛋白质,可将细胞内的Na+释放到胞外同时将胞外的K+运输入细胞,Ca2+-ATPase对维持细胞正常生命活动至关重要[13]。由图2可知,在24 h内,SA中Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力呈先上升后下降的变化趋势,CK酶活力相对稳定。添加胡椒单萜类化合物后L.monocytogenes的Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力在0～4 h均显著升高(p<0.05),在4～24 h显著下降(p<0.05),16～24 h SA显著低于CK组(p<0.05),Na+-K+-ATPase活力迅速下降可使细胞膜内外形成H+梯度差,H+梯度差会改变细胞膜的通透性[14]。添加胡椒单萜类化合物后可能破坏了L.monocytogenes的细胞膜,使细胞膜的通透性增加,改变细胞膜的流动性,从而影响Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性[15]。Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力降低导致细胞内多肽和蛋白质不能正常合成和分解,酶活力的变化会进一步改变膜的通透性,从而加快细胞凋亡[16-18]。

图2 单核增生李斯特菌Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力随时间的变化Fig.2 Changes of the cctivities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase in L. monocytogenes with time

2.3 胡椒单萜类化合物对单核增生李斯特菌的蛋白组变化研究

在质谱图中,任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。在串联质谱中,根据波峰的高度及面积,可以得到蛋白质的定量信息,寻找差异表达蛋白,分析蛋白功能。本研究对CK 0 h,SA 0 h,CK 8 h,SA 8 h,SA 24 h,CK 24 h六组数据两两进行比较,筛选出1.2倍以上的差异蛋白[5]。

由图3可知,差异蛋白最多的是SA 24 h/CK 24 h,最少的是SA 0 h/CK 0 h,所以添加胡椒单萜类化合物后,L.monocytogene中差异蛋白数量与处理时间成正比。SA 24 h/CK 24 h中上调蛋白数量显著高于高于下调蛋白(p<0.05),L.monocytogene生理状态可能受到胡椒单萜类化合物的影响,上调蛋白数量占多数,有着更多的生物学进程被激活。实验组 SA 0 h,SA 8 h,SA 24 h 三者之间进行互相比较,同样也产生了差异蛋白,但相比 SA 8 h/CK 8 h和SA 24 h/CK 24 h差异蛋白的数量显著降低(p<0.05),差异蛋白中上调蛋白和下调蛋白数目接近,这些差异蛋白应该是L.monocytogenes正常生长过程中的蛋白变化[8]。

图3 胡椒单萜类化合物处理组差异蛋白统计Fig.3 Statistics of differential protein in the treatment group of pepper monoterpenoids注:图中不同字母表示差异显著(p<0.05)。

2.4 胡椒单萜类化合物对L. monocytogenes呼吸链复合体Ⅰ-Ⅴ的影响

由表1可知,L.monocytogene呼吸链复合体I～V活力均呈下降趋势,在8～24 h添加胡椒单萜类化合物后呼吸链复合体I和V活力显著低于对照组(p<0.05)。呼吸链可为细胞提供维持正常生命活动所需的ATP,L.monocytogene的呼吸链位于质膜上。胡椒单萜类化合物可能通过抑制L.monocytogene呼吸链复合体活性减弱呼吸作用,阻断电子从NADH到辅酶Q的传递,导致维持L.monocytogene正常生命活动的ATP和蛋白质不能及时合成,从而导致菌体衰亡。结合差异蛋白的统计结果来看,胡椒单萜类化合物可能抑制酶复合物蛋白的形成,从而引发酶复合物蛋白表达量的巨大变化。

表1 单核增生李斯特菌呼吸链复合体Ⅰ-Ⅴ活力随时间的变化Table 1 Changes of Ⅰ-Ⅴ activity of LM respiratory chain complex with time

呼吸电子传递链是能量代谢过程中重要的组成部分,任何一个复合体活性受到抑制都将导致生物体不能正常地合成ATP,进而衰竭死亡[19]。

2.5 胡椒单萜类化合物与L. monocytogene呼吸链蛋白同源模建

同源模建方法是基于序列的同源性决定了三维结构的同源性的原理,是目前预测蛋白质三级结构常用的方法。如果两个蛋白质三维结构的保守性比氨基酸序列的保守性高,则两个蛋白质在三维结构上也会具有很高的相似性,我们称这两个蛋白质为同源蛋白。当待测蛋白与模板蛋白的序列同源性在50%以上时,两个蛋白中约有90%以上氨基酸残基的空间结构是一致的,序列同源性达到30%以上时,同源模建预测得到的结果是可信的。分子对接的本质是通过化学计量学的方法,对结构已知的配体分子与受体分子发生相互结合过程的模拟,明确两分子在结合时发生的几何结构以及相互作用力的改变,进而对其相互作用形式与机理进行预测。分子对接能够准确预测蛋白质受体的活性结合位点与配体的结合形式[20]。

通过对同源模建模型与胡椒单萜类化合物多肽的对接结果的分析,在对以98个同源模建模型,L.monocytogene菌体蛋白(受体)与胡椒单萜类化合物多肽(配体)进行分子对接中,有11个模型具有与胡椒单萜类化合物多肽结合的可能性,并且这些蛋白全部集中在呼吸链复合体I和V中。表2是胡椒单萜类化合物多肽结合具有活性的呼吸链蛋白,序号1代表同源模建全局模型质量评估(QMQE)得分,序号1为0.7以上,代表建模情况最好,序号2～3为0.5以上,4～11为0.5～0.3。

表2 具有胡椒单萜类化合物多肽对接活性的呼吸链复合体Table 2 Respiratory chain complex with docking activity of pepper monoterpenoids and polypeptides

2.6 胡椒单萜类化合物与L. monocytogenes呼吸链蛋白分子对接及抑制位点的确定

以L.monocytogenes为供试菌,利用Discovery Studio2.1中的Build and Edit protein,以胡椒单萜类化合物为配体,L.monocytogenes菌体蛋白为受体,进行分子对接,结果得到5条胡椒单萜类化合物与L.monocytogenes菌体蛋白对接成功(如图4),通过London d G打分函数排序找出具有与胡椒单萜类化合物分子结合活性蛋白,这些蛋白质全部集中在L.monocytogenes呼吸链上复合体I和V中,包括十个肽段,这些肽段与胡椒单萜类化合物的亲和能得分较高,考虑空间位阻,疏水作用、氢键作用及范德华力判断其结合活性较为可靠;综合前文所得复合体V在蛋白水平明显下调,说明其在翻译后阶段受到强烈调控。

3 结论

相比空白对照组,添加胡椒单萜类化合物可抑制L.monocytogenes的生长,同时Na+-K+-ATPase、Ca2+-ATPase、呼吸链复合体I～V活力均降低,其中复合体V在蛋白水平显著下调,说明其在翻译及翻译后阶段受到强烈调控。结合同源模建和分子对接的结果,我们推测复合体V是胡椒单萜类化合物对L.monocytogenes呼吸链的重要抑制位点。胡椒单萜类化合物可使L.monocytogenes细胞膜通透性发生变化,维持L.monocytogenes正常生命活动的ATP和蛋白质不能及时合成,从而导致菌体衰亡。