酱香大曲间微生物群落结构时空特征的表征

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(1.四川大学轻纺与食品学院,四川成都 610065;2.皮革化学与工程教育部重点实验室,四川成都 610065;3.国家固态酿造工程技术研究中心,四川泸州 646000)

酿酒大曲既是中国传统白酒生产过程必需的发酵剂和粗酶制剂,又是重要的酿酒原料,在白酒的酿造过程中,影响微生物群落的繁殖与代谢的同时,也与基酒独特风味的形成密切相关[1-2]。大曲的群落及风味特征主要取决于环境温度和湿度等参数。这些参数在制曲过程中对群落结构的定向驯化,对群落代谢调控及产物的形成具有重要的作用。酱香型大曲群落中优势菌群组成类似其所用的高温大曲,与所用原料中的优势菌群结构类似。二者的优势细菌都是芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和链霉菌(Streptomyces)[3-6]等,丰度最高之一的Bacillus分泌的代谢产物包括水解酶类和吡嗪类等,后者对酱香型大曲酒独特风味形成的贡献显著[7-10]。疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、汉森酵母属(Hansenula)、念珠菌(Candida)和毕赤酵母属(Pichia)则是其优势真菌[11],其丰度对生物活性组分(如多种水解酶等)的影响显著[12]。王晓丹等[13]对贵州省三个酱香型大曲细菌群落结构的高通量测序结果表明,高温放线菌属(Thermoactinomyces)的丰度最高,Bacillus和Scopulibacillus次之,与已有的报道略有不同,如Bacillus被认为丰度是最高[5-6],或未检出Thermoactinomyces[14],可能与检测方法与条件有关。

中国赤水河流域星罗密布酱香型白酒企业,生产方法相似,但产品风格迥异,可能是大曲群落及代谢组分的差异所致。本文叙述了基于高通量测序技术，研究生产区域、企业、场地及陈曲时间不同样品的微生物群落组成的差异,经聚类和非度量多维测度分析(non-metric multidimensional scaling analysis,NMDS)等方法揭示其群落结构的时空性特征的结果，以期为传承和优化酱香大曲生产工艺奠定重要方法学及实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

MBQ(茅台镇大曲) 取自贵州省怀仁市茅台镇的著名酱香型白酒集股份有限公司;MEQ(习酒镇大曲) 取自上述集团公司在贵州省习水县习酒镇生产基地;LEQ(二郎镇大曲)、LGQ(黄荆坝大曲) 分别取自四川省古蔺县二郎镇(与习酒镇是隔赤水河相邻)某著名酱香型白酒股份有限公司两个不同生产基地;XTQ(仙潭镇三月大曲)、XXQ(仙潭镇六月大曲) 取自四川省古蔺县太平镇(与二郎镇仅距30km)的大型酱香型白酒企业的陈曲时间分别是3个月和6个月的样品;Tris-HCl、EDTA、CTAB、SDS、纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶和蛋白酶K(分析纯) 均购买于上海生工生物工程有限公司(中国上海)。

PCR仪 美国S 100 TM Thermal Cycler Bio-Rad公司;Gel DocTM XR凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司;TGL 16M高速冷冻离心机 湘麓离心机仪器公司;手提式高压灭菌锅 上海医疗卫生仪器厂;Illumina Miseq测序仪 美国Illumina;Nanodrop NC2000微量UV分光光度仪 Thermo Scientific(上海)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 为了解MBQ在酱香型大曲的特殊性,参考DB52/T 871-2014,从其曲表、黑台层、曲底和曲心等4个颜色不同部位取样;其余5种不同样品则分别从其曲表和曲心取样。采用4点取样法分别从样品部位的各位点取样,混合均匀后取100 g用于分析。各样品的详细信息见表1。

表1 各样品信息Table 1 Information of various samples

1.2.2 DNA提取 样品的菌体收集、DNA提取参考Zhang等[15]方法完成。主要步骤如下:称取5 g大曲和3 g玻珠置于50 mL灭菌的离心管中,加入25 mL的磷酸盐缓冲溶液(PBS,0.1 mol/L,pH8.0),涡旋5 min,离心10 min(1000 r/min,4 ℃)收集上清液,重复3次,汇集所得的上清液。然后将其离心10 min(12000 r/min,4 ℃)收集菌团,-20 ℃保存待用。冻融研磨加酶助法提取DNA。DNA提取液为 0.1 mol/L Tris-HCL(含0.1 mol/L EDTA,1.5 mol/L NaCl,1% CTAB,pH=8.0),混合酶液由纤维素酶(75 mg/mL)、蜗牛酶(50 mg/mL)和溶菌酶(50 mg/mL)组成。提取的DNA经2% 的琼脂糖凝胶电泳检测和微量UV分光光度仪定量。

1.2.3 PCR扩增 分别用通用引物520F/802R和ITS2/ITS5扩增细菌V3-V4和真菌ITS1变异区。PCR体系:0.5 μL DNA聚合酶,5 μL 5×buffer,5 μL 5×High GC buffer,0.5 μL DNTP(10 mmol/L),1 μL DNA模板,1 μL正向引物(10 mmol/L),1 μL反向引物(10 mmol/L),11 μL ddH2O。PCR程序:98 ℃,30 s;(98 ℃,15 s;50 ℃,30 s;72 ℃,30 s)×27,72 ℃,5 min,4 ℃,反向。

1.2.4 样品PCR纯化及测序 委托上海派森诺生物科技有限公司对PCR产物纯化,并使用Illumina MiSeq 2×300 platform(Illumina Inc,San Diego.CA)测序。

1.3 数据处理

使用QIIME(v1.8.0,1http://qiime.org/)完成过滤及去除嵌合体,具体操作是:去除5′端引物错配碱基>1的序列和含有N(模糊碱基)的序列;去除含量连续相同碱基数>8的序列,及USEARCH(v5.2.236,http://www.drive5.com/usearch)推测的嵌合体。经UCLUST(v1.1.579)对相似长度≥150 bp及相似度≥97%聚类为相同的操作单元(operational taxonomic units,OUT),随后根据Greengenes(Release 13.8 http://greengenes.secondgenome.com)和UNITE数据库(Release 5.0,https://unite.ut.ee/),进行不同水平的分类(界、门、纲、目、科、属、种)。分别用Mothur(v1.31.2)和QIIME(V1.8.0,http://qiime.org/)评估OTUs丰度≥0.5%α-和β-多样性。应用R软件(https://www.r-project.org/)完成热图,实现可视化及聚类和非度量多维测度分析。

2 结果与分析

2.1 PCR电泳结果

如图1所示,样品中微生物总DNA的真菌ITS1和细菌V3-V4变异区的PCR结果的条带清晰度和DNA电泳位置分别在300、500 bp左右,满足后续检测结果的要求。

图1 ITS1和V3-V4基因片段区PCR扩增结果Fig.1 PCR results of ITS and V3-V4 gene region注:(a)和(c):ITS1基因片段PCR扩增结果;(b)和(d):V3-V4基因片段区扩增结果。

2.2 群落α和β多样性的时空性特征

本研究中的菌株序列已经提交到GenBank(美国)数据库,申请得到国际基因库接受号:SRP135846。

如表2所示,14个样品有效的细菌和真菌序列分别为36082～51255和48640～81082,高质量序列平均数分别是37912、60641,是有效平均序列的85.97%和96.86%。微生物累积曲线随着测序的样本数的增加渐变平缓(图2),表明测序样本数能反映其群落结构的特点。不同生产区域、产地和陈曲时间及部位的样品间α多样性差异明显(表3)。除了MBQ和LEQ,曲心中细菌的物种丰富度指数高于曲表;除了MEQ,曲心中真菌的物种丰富度指数也高于曲表。相应地,除了MBQ,曲心中的细菌多样性指数略高于曲表,MBQ和LEQ等样品的曲心中的真菌多样性指数也略高于曲表。陈曲过程中(从3个月延长到6个月)曲心的细菌丰富度和多样性指数都增高,而曲表则相反,同时,曲心和曲表的真菌物种丰富度指数都略减。

图2 样品的细菌(a)和真菌物种(b)累积曲线Fig.2 Specaccum curve based on the observed bacterial(a)and fungal(b)quantity

表2 不同酱曲样品之间高质量真菌和细菌序列数的差异Table 2 Difference of high quality sequence based on 16S rRNA and ITS

表3 样品间微生物群落的α-多样性的差异Table 3 Difference of α-diversity among samples

测序结果表明,这些样品的细菌包括6个门,分别是厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和柔膜菌门(Tenericutes),真菌则包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌类(Zygomycota)及未确定群类。其中Firmicutes和Ascomycota分别是丰度最高细菌和真菌。不同种类大曲的曲心和曲表间的细菌和真菌群落差异明显。Firmicutes和Proteobacteria的丰度之和超过细菌丰度的89.30%,而Ascomycota、Basidiomycota的丰度之和高于真菌丰度的94.04%。丰度高于1%以上的属水平种类热图聚类分析的结果(图3)表明,曲心和曲表群落结构差异明显。MBH的细菌群落单独聚为一类,而其真菌群落则与MBA和XTH的聚为一类,其中MBH和MBA则又聚为一亚类。样品的细菌聚类的另一族中,曲心和曲表分别归类为两个亚族,其中LEA和LGA聚为一个子族,XXA和XTA聚在一起,曲心则仅有XXH和MEH聚在一起。同样地,真菌群落热图分析中另一族的样品中,XXA和XTA相邻,且与LGH聚在同一子族,LEH和LEA相邻,且与XXH聚在一小类中。颜色由深至浅表示的样品间,各种属水平微生物的OTU相对含量大小表明其差异性分布特点。

图3 不同样品的优势菌(OUT>1%)的聚类分析Fig.3 Cluster analysis of dominant microbial community(OUT>1%)among the various samples 注:(a):细菌,(b):真菌;*表示该微生物科中某一特定的属(目前没有统一命名)。

NMDS分析的结果进一步揭示了样品群落结构的差异。除茅台原产地大曲曲心,其余5种大曲样品的曲心的真菌和细菌物种种类组成类似,但曲表样品的组成则呈现较大差异(非加权NMDS,图4a和图4c),LGA和MEA较为近似。但各物种数量则是在曲心间差异显著,而曲表间类似(加权NMDS,图4b和图4d)。MBQ中微生物群落中物种数量及各属水平微生物物种数及数量均差异明显。

图4 NMDS排序结果图Fig.4 Non-metric multidimensional ordination result graph注:(a)细菌非加权;(b)细菌加权;(c)真菌非加权;(d)真菌加权。

2.3 群落中的优势菌的时空性特征

在这些样品中检出了116个不同的细菌属和61个的真菌属,分别属于20个细菌目,21个真菌目(图5)。优势的细菌属(OTU>1%)属于芽胞杆菌目(Bacillales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、放线菌目(Actinomycetales)和乳酸杆菌目(Lactobacillales)等4个不同的目,其丰度之和超过96.84%,与Wang等[4]和Liu等[5]的报道结果是一致的,但样品间优势菌的丰度的差异明显。除LEQ和LGQ以外,Bacillales和Lactobacillales分别在曲心和曲表中占优势,前者在曲心的比例为24.71%～68.59%,后者在曲表中为55.89%～80.91%。

曲表的优势细菌属，其种类差异较小,肠球菌属(Enterococcus)是除LGA和LEA外的优势菌(55.89%～80.91%),而肠杆菌科未定属(Enterobacteriaceae_G,59.61%)和芽胞杆菌科未定属(Bacillaceae_G,57.77%)分别是LEA和LGA中最优势的细菌属。乳酸是Enterococcus和Enterobacteriaceae的主要代谢产物之一。乳酸不仅是乳酸酯前体,且具有抑制杂菌等作用,所以在酱香大曲酒生产过程中Enterococcus和Enterobacteriaceae的贡献待深入研究。与曲表样品不同,不同酱香型大曲曲心样品中优势的细菌属种类差异明显。Bacillaceae_G是在曲心样品中的主要优势菌,丰度为24.71%～68.59%,此外Bacillus、Staphylococcus和Thermoactinomyces等在取心中的丰度同样较高,其中Bacillus是既能合成吡嗪类等酱香型大曲酒特殊组分的生物合成者[7,10,16],又产水解酶类[17]。虽然已在浓香和酱香型大曲及多种传统发酵食品中检出了Staphylococcus[18],但其作用尚待深入探讨。Thermoactinomyces作为大曲中优势细菌[13,18-19],产生各种水解酶,如碱性磷酸酶、酯化酶、液化酶和磷酸水解酶等[20],在白酒酿造过程中具有重要的作用。

茅台大曲的曲心样品(MBH)中优势细菌包括Staphylococcus、Bacillus、动球菌科未定属(Planococcaceae_G)和Bacillaceae_G等,其丰度分别是38.70%、11.19%、4.33%和39.55%,后二者在在MEH也是优势菌属,其丰度分别占66.32%和10.25%。在MBC中,片球菌属(Pediococus)和Enterococcus丰度分别是66.12%和11.09%,而在MBD中,这二者及乳酸杆菌科未定属(Lactobacillaceae_G)、明串珠菌科未定属(Leuconostocaceae_G)的丰度分别是43.01%、22.16%、14.87%和16.33%。LEH中的Thermoactinomyces、Bacillaceae_G和Enterobacteriaceae_G的丰度分别是38.35%、30.95%和10.49%。LGH中的欧文氏菌属(Rwinia)和Enterobacteriaceae_G的丰度分别是32.07%和27.06%。增加3个月时间后,曲心中优势细菌的构成发生显著变化,除Bacillaceae_G外,XTH的优势菌属是Thermoactinomyces(15.52%),而在XXH中,Planococcaceae_G(10.87%)和Enterobacteriaceae_G(16.82%)是优势菌。

如图5b所示,酱香型大曲中的优势真菌属包括木霉属(Trichoderma)、假丝酵母(Candida)、曲霉菌(Aspergillus)、嗜热真菌属(Thermomyces)、嗜热子囊菌属(Thermoacus)、拟青霉属(Paecilomyces)和丝孢酵母属(Trichosporon)等7个不同属,其丰度在74.80%～97.88%间。乙醇、异戊醇和苯乙醇是Candida主要代谢产物[21],而包括蛋白酶和淀粉酶在内的水解酶是Aspergillus是代谢产物,且这些真菌还产生多种挥发组分及前体[22]。Thermomyces、Thermoacus和Trichoderma等菌则与纤维素降解酶(纤维素酶及葡萄糖苷酶等)及淀粉水解酶(葡萄糖)的合成有关[23-25]。尽管Trichosporon在酿酒过程的作用尚不清楚,但产脂肪酶及酯化能力还是引人关注[26]。

图5 样品中优势种属组成轮廓图(OUT>1%)Fig.5 Dominant microbial community profiles in various samples(OUT>1%)注:a:细菌,b:真菌,*表示表示该微生物科中某一特定的属(目前没有统一命名)。

在MBH和MBA中,Aspergillus的丰度分别是32.61%和64.83%,此外在前者Candida(32.25%)和Trichoderma(16.79%)也是优势菌。Candida在MBC(75.87%)和MBD(43.27%)的丰度差异显著,同时Thermomyces在后者的丰度是21.23%。由此可见,茅台大曲中的Aspergillus、Candida、Trichoderma和Thermomyces等4个属真菌为优势菌。同企业因生产区域及产地不同,其样品的优势真菌丰度也有较大差异。如MBH的Trichoderma和Aspergillus的丰度分别是16.79%和32.61%,MEH中为45.58%和1.40%,在MBA和MEA中Trichosporon的丰度分别是6.57%和30.55%。类似的,LEQ和LGQ曲心和曲表样品间Trichoderma、Aspergillus、Thermoacus和Paecilomyces的丰度也有较大差异。增长3个月陈曲时间,优势真菌的丰富度发生明显改变,其中嗜热真菌属(Thermomyces)和嗜热子囊菌属(Thermoacus)的丰富度增加,木霉属(Trichoderma)和丝孢酵母属(Trichosporon)则减少。木霉属(Trichoderma)在曲心中增高,但在曲表中则减少,假丝酵母(Candida)在曲心中显著增高,但在曲表中略减少。

3 结论

应用宏基基因测序技术剖析产地、不同企业、生产场地及陈曲时间对酱香型大曲群落组成及群落多样性的特征,结果表明,酱香型大曲的优势细菌主要包括由Bacillales、Enterobacteriales、Lactobacillales和Actinomycetales等4个目,而优势真菌则是Saccharomycetales、Hypocreales、Eurotiales和Trichosporonales等4个目,茅台大曲中Staphylococcus、Bacillus、Pediococus、Candida和Aspergillus的丰度高于其它5种大曲的,而其它5种大曲的群落结构组成及多样性也差异明显,陈曲时间明显地影响群落的多样性。测序结果的NMDS分析表明,除茅台原产地大曲曲心,各种大曲样品的曲心的真菌和细菌物种种类组成类似,但优势物种种类差异较大;相反,曲表的微生物组成种类差异较大,但共有优势物种种类及丰度相似。其结果揭示了酱香型大曲的微生物群落具有显著的时空性特征。