生防酵母菌株的分离筛选及其防治苹果果实轮纹病效果

戴忠良 高克祥

摘要：为有效防控采后苹果果实轮纹病，从泰安市三地果园不同果树的叶片和果实中分离出30株酵母菌，分别进行离体抑菌活性测定和活体防病效果筛选，其中4株酵母菌抑菌活性较强，对4株酵母菌不同处理液对病原菌生长的影响、不同浓度下的防治效果及在苹果果实上的生长定殖动态等进行了研究。结果表明：酵母菌株H3、T2、T3、Z8对苹果轮纹病菌抑菌作用较强，第8 d的抑菌率分别为91.46%、91.06%、77.20%、88.66%。接种浓度为1×108 cfu/mL的酵母菌7 d后，其防病效果分别是65.1%、82.5%、69.8%、84.1%。培养原液和菌悬液对病原菌抑制作用较强，菌落平均直径小于4 cm。显微镜观察发现只有菌株T3具有重寄生作用。酵母菌与病菌菌丝共培养试验中，酵母菌对菌丝生长量的抑制率都在99%以上。酵母菌浓度越高，防病效果越好，其中菌株Z8的防治效果达到59.4%。4株酵母菌在YPD培养基和苹果伤口中呈指数型增长，在YPD培养基中24 h达到峰值，在苹果伤口上48 h达到峰值。经形态学和分子生物学初步鉴定，4株酵母菌均属于季也蒙迈耶氏酵母（Meyerozyma guilliermondii）。

关键词：酵母菌；果蔬采后病害；苹果果实轮纹病；拮抗作用；生物防治

中图分类号：S436.611.1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）09-0102-07

Abstract In order to prevent and control apple fruit ring rot effectively， 30 yeast strains were isolated from the leaves and fruits in three orchards in Taian. Their inhibition activity and disease prevention effects were screened in vivo， and four strains were selected with stronger bacteriostasis.The effects of different treatment solutions of the four yeast strains on the growth of pathogen， the control effect of different concentrations and the growth and colonization on apple fruit were studied. The results showed that the yeast strains H3， T2， T3 and Z8 had stronger inhibition against pathogen of apple fruit ring rot， and their inhibition rates were 91.46%， 91.06%， 77.20% and 88.66%， respectively. After inoculation with 1×108 cfu/mL yeast for 7 d， the disease control effect was 65.1%， 82.5%， 69.8% and 84.1%， respectively. The inhibitory effect of yeast culture solution and yeast cell suspension on pathogens was stronger， and the average diameter of colonies was less than 4 cm. Microscopic observation showed that only strain T3 had mycoparasitism. In the co-culture experiment of yeast and pathogen mycelium， the inhibition rate of yeast to mycelia growth was over 99%. The higher the yeast concentration， the better the disease control effect and the control effect of strain Z8 reached 59.4%. The concentration of the 4 yeast strains increased exponentially in YPD medium and apple wounds. The peak reached after 24 h in YPD medium， and 48 h on apple wound. According to morphological and molecular biology， the 4 yeast strains were preliminarily identified as Meyerozyma guilliermondii.

Keywords Yeast； Postharvest diseases of fruits and vegetables； Apple fruit ring rot； Antagonism； Biocontrol

果蔬采后病害造成的经济损失巨大，目前主要防治方法是使用化學杀菌剂，但化学方法存在增强病原菌抗药性、危害环境和人体健康等问题。生物防治具有长效、环保、安全的特点，逐渐受到人们青睐。研究结果表明，对果蔬采后病害有生防作用的微生物有细菌、霉菌和酵母菌等[1]。其中酵母菌具有拮抗效果好、安全、抗逆性强、繁殖速度快、遗传稳定等优点，逐渐成为研究热点。现已报道的对果蔬采后病害具有明显抑菌作用的酵母菌有20多种，例如隐球酵母属的Cryptococcus infirmo-miniatus、罗伦隐球酵母（C. laurentii）和红酵母属的粘红酵母（Rhodotorula glutinis）对梨病害有较好的抑菌效果，C. infirmo-miniatus和粘红酵母在采收前一天对梨进行处理，能有效控制梨的采后腐烂[2]；Mercier等[3]的研究发现，季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii）对由灰葡萄孢霉及黑曲霉引起的葡萄腐烂具有明显的抑制效果，与只接种病菌的对照相比，分别可以减少16.81%和60.00%的腐烂损失。

富士苹果对轮纹病菌高度感病，尤其在胶东半岛、华北等中部高温多雨地区发生普遍[4]。苹果轮纹病既可以危害枝干，又可以直接侵染果实甚至潜伏至储藏期危害采后果实。苹果果实往往从接近成熟时开始发病，可持续至储藏期，严重年份苹果果实损失超过70%。苹果轮纹病已成为重要的采后病害，给苹果采后储藏造成巨大的经济损失[5]。因此，迫切需要研究安全有效的生物防治方法。

本试验的目的主要是筛选对苹果果实轮纹病有开发应用潜力的拮抗酵母菌株，研究不同酵母菌处理液对病原菌生长的影响、不同浓度酵母菌对苹果轮纹病的防治效果、酵母菌在苹果果实上的生长定殖动态等，以期为拮抗酵母菌在防治果蔬采后病害中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌菌株

苹果果实轮纹病菌[贝伦格葡萄座腔菌（Botryosphaeria berengeriana）]为本实验室保存菌种。

1.2 供试苹果

供试苹果采购于泰安市水果批发市场。选择无病害、无伤口、成熟度和大小一致的富士苹果，0℃下贮藏，备用。

1.3 酵母菌的分离与纯化

1.3.1 样本的采集 2016年9—10月分别从山东农业大学南校植保试验站、山东省泰安市省庄镇许家埠村、泰安市道朗镇玄家庄村采集苹果、桃、柿子、枣、海棠等的果实、叶片和土壤样品。采样方法：①果实样品：不同地点随机取样，分别取健康和有伤口的果实两种，装入塑料袋内并标记时间、地点和品种。②叶片样品：不同地点随机剪取叶片，装入塑料袋内，标记时间、地点和品种。③土壤样品：在树冠滴水线处，用取样铲将表层5 cm左右的浮土除去，取5～15 cm处的土样约10～20 g，装入样品袋并标记地点、时间及环境条件。样品取回后，及时晾干。压碎后过孔径为0.6 mm筛，备用。

1.3.2 酵母菌的分离与纯化 ①表面分离法：参考Janisiewicz 等[6]的方法，取每个品种果实数个于大烧杯中，加入适量浓度为0.05 mol/L、pH 6.8的磷酸缓冲液，100 r/min振荡10 min。弃去洗液，再将果实放入磷酸缓冲液中，用超声波清洗30 min，取洗液。将洗液梯度稀释成10-3、10-4、10-5、10-6，各取100 μL分别涂布于PDA 培养基上，25℃培养2～3 d，挑取单菌落在新PDA平板上划线，2 d后进行镜检，对酵母或类似酵母的单菌落进行单细胞纯化培养。叶片样品同样采用表面分离法。②土壤梯度稀释分离法：参照方中达[7]的方法，称取研细的土样5 g，加入盛有45 mL灭菌水的三角瓶中，充分振荡10 min，制成1∶ 10浓度的土壤悬浮液。待土粒沉淀后，将土壤悬浮液梯度稀释成10-3、10-4、10-5，各取100 μL分别于PDA培养基上涂布，25℃培养2～3 d，挑取单菌落在新PDA平板上划线，2 d后进行镜检，对酵母或类似酵母的单菌落进行单细胞纯化培养。

1.3.3 培养基 ①PDB培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，加水定容至1 000 mL，自然pH。如制固体培养基加入20 g琼脂。121℃高温高压蒸汽灭菌25 min。②YPD培养基：A液：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，加水定容至900 mL，自然pH。B液：葡萄糖20 g，加水定容至100 mL，自然pH。121℃高温高压蒸汽灭菌25 min。A液∶ B液=9∶ 1混合均匀使用。

1.4 酵母菌株离体抑菌与活体防病试验

1.4.1 酵母菌悬液的制备 将已纯化的酵母菌接种在YPD培养基中，28℃、180 r/min振荡培养48 h。将培养好的菌液6 000 r/min离心10 min，弃上清，无菌水反复清洗离心3次（去除培养基），用血球计数板计数并配成浓度为1×108 cfu/mL的酵母菌悬液，备用。

1.4.2 离体抑菌试验 取100 μL浓度为1×108 cfu/mL的酵母菌悬液均匀涂布在PDA平板上，在PDA平板中心放置培养5 d、直径为4 mm的病原菌菌饼，25℃恒温培养，每天观察菌丝生长情况。4 d后采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径。每处理重复3次，无菌水处理作为对照。

抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100 。

1.4.3 活体防病试验 选取无病、无伤口、成熟度和大小一致的富士苹果，用2%次氯酸钠溶液浸泡5 min，自来水冲洗干净，自然晾干，备用。在果实的腰部用消毒的打孔器打3个直径和深度为4 mm的伤口，向每个伤口中注入30 μL浓度为1×108 cfu/mL的酵母菌悬液。取一塑料盒，在塑料盒底部铺满一层卫生纸，倒入灭菌水，然后在卫生纸上面紧密地放满一层培养皿（防止苹果直接接触水，加速腐烂），将处理的苹果放到培养皿上，保鲜膜覆盖塑料盒进行保湿，25℃恒温培养。24 h后，将病原菌菌饼接种到伤口中，继续25℃恒温培养，每天观察并拍照，第7 d统计发病率、病情指数和相对防治效果。每处理重复3次，每重复6个果实，无菌水处理作为对照。苹果果实轮纹病害分级标准：0级，果实病斑直径0～1 cm；1级，果实病斑直径>1～2 cm；2级，果实病斑直径>2～3 cm；3级，果實病斑直径>3～4 cm；4级，果实病斑直径>4～5 cm；5级，果实病斑直径>5～6 cm。

病情指数=∑（各级病斑数×各级代表值）/（调查病斑总数×最高级别代表的数值）×100 。

防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100 。

1.5 不同酵母菌处理液对病原菌生长的影响

1.5.1 酵母菌处理液的制备 ①酵母菌悬液：方法同1.4.1。②酵母菌培养原液：取纯化后酵母菌接种在30 mL YPD培养基中，28℃、150 r/min振荡培养。用血球计数板计数并配成1×108 cfu/mL的酵母菌培养原液，备用。③酵母菌高温处理液：将酵母菌悬液于121℃高压蒸汽灭菌25 min，备用。④酵母菌上清液：将30 mL酵母菌培养原液6 000 r/min离心7 min，取上清液并用0.22 μm细菌过滤器过滤（彻底除去酵母细胞），备用。

1.5.2 不同酵母菌处理液的抑菌试验 选取拮抗效果较好的4株酵母菌进行试验。取0.1 mL酵母菌处理液涂布在PDA平板上，10 min后，在平板的中心接入培养5 d、直径为4 mm的病原菌菌饼，25℃恒温培养。每处理重复3次，以涂布无菌水的PDA平板为对照。每天观察并拍照，4 d后采用十字交叉法测量病原菌菌落直径。

1.6 酵母菌对病原菌的重寄生作用和对菌丝生长量的影响试验

将培养5 d的苹果轮纹病病原菌菌丝配成菌丝悬浮液。将10 mL菌丝悬浮液和供试酵母菌悬液（最终浓度1×104 cfu/mL）分别加到装有100 mL PDB培养基的锥形瓶中，25℃、80 r/min恒温振荡培养，5 d后于40倍显微镜下观察。培养物用纱布过滤，收集病原菌菌丝，烘干后称重。

抑菌率（%）=（对照菌丝干重-处理菌丝干重）/对照菌丝干重×100 。

1.7 不同浓度酵母菌对苹果果实轮纹病的防治效果试验

方法同1.4.3活体防病试验。向不同伤口注入30 μL浓度分别为1×104、1×106、1×108 cfu/mL的酵母菌悬液。每处理重复3次，每重复6个果实，无菌水处理作为对照。

1.8 酵母菌生长动态的测定

1.8.1 酵母菌在YPD培养基中生长动态的测定 分别将4株酵母菌加到YPD培养基中，使其最终浓度为1×104 cfu/mL，28℃、160 r/min振荡培养，1 h后开始取样，每间隔1 h取样一次，共取样30次。试验重复3次。将所测酵母菌的浓度值转化成其对数值。

1.8.2 酵母菌在苹果果实伤口上生长动态的测定 按照Jansiiewicz等[8]的方法测定4株酵母菌在果实伤口的生长动态。取30 μL浓度为1×106 cfu/mL酵母菌悬液于果实伤口中，1 h后测定的酵母菌浓度为起始值（0 h）。将接种的苹果放入塑料盒中保湿，方法同1.4.3活体防病试验。测定酵母菌浓度的方法：用打孔器从伤口处取直径和深度为4 mm的果肉组织放于研钵内研磨，用梯度稀释平板法记数。每处理重复3次，每重复3个果实。

1.9 酵母菌株的鉴定

1.9.1 形态观察 观察酵母菌在培养基中菌落形态，在100倍显微镜下观察酵母菌单细胞形态并拍照。

1.9.2 分子鉴定 用酵母基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取酵母DNA基因组。采用26S rDNA D1/D2区基因序列通用引物扩增[9]。引物NL1： 5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，引物NL4： 5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。50 μL反应体系：Buffer 5 μL，dNTPS 4 μL，引物NL1（10 μmol/μL）和引物NL4（10 μmol/μL）均为2 μL，Taq酶1 μL，模板DNA 4 μL，ddH2O 32 μL。反应程序：95℃ 5 min；94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min，36个循环；72℃ 7 min[10， 11]。产物在1%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳40 min，置于凝胶成像仪中检测，目标条带经切胶回收纯化，送至上海博尚生物技术有限公司进行测序。测定的序列提交至GenBank数据库中与现有的近缘菌株序列比较。用MEGA 6.0软件以最大似然法构建系统发育进化树，分析供试菌株与已知酵母菌的亲缘关系[12]，确定分类地位。

2 结果与分析

2.1 酵母菌株的分离纯化结果

本试验共分离纯化得到30株酵母菌，于-20℃甘油中保存。30株酵母菌均分离于果实和叶片中，土壤中未分离到酵母菌株（表1）。由于果实和叶片中含有丰富的营养和水分，环境条件更利于酵母菌的生长和繁殖，所以更易从中分离。

2.2 离体筛选试验结果

平板对峙试验结果显示，大部分酵母菌对苹果轮纹病菌具有一定的拮抗作用，拮抗效果比较好的酵母菌株有H22、H3、H4、H5、PY5、S5、T2、T3、T7、Z5、Z8（表2）。将其用于后续的活体防病试验。

2.3 活体防病试验结果

根据发病率、病情指数和防治效果，拮抗效果较好的酵母菌株有H3、T2、T3、Z8。其中Z8的防治效果最好，发病率只有27.8%，防治效果为84.1%；T2的防治效果次之，为82.5%（表3）。

2.4 不同酵母菌株处理液对病原菌生长的影响

4株酵母菌的菌悬液和培养原液对病原菌的生长具有显著的抑制作用，但上清液和高温处理液对病原菌的生长没有抑制作用（表4），说明培养原液中对病原菌起抑制作用的是酵母细胞，而不是酵母细胞分泌物。2.5 酵母菌对病原菌的重寄生作用和对菌丝生长量的影响

显微镜观察发现酵母菌株T3有较多的菌体细胞吸附于病原菌的菌丝上，表明其对病原菌菌丝具有重寄生作用，其他3个菌株没有明显的重寄生作用，其抑制病原菌的機理有待进一步研究。但4株酵母菌都能抑制苹果果实轮纹病菌菌丝的生长，与对照相比，病原菌菌丝的生长量明显降低（图1，表5）。

2.6 不同浓度酵母菌对苹果果实轮纹病的防治效果

酵母菌浓度越高对苹果果实轮纹病的防治效果越好，其中防治效果最好的是菌株Z8，防治效果为59.4%，而浓度为1×104 cfu/mL时，防治效果较差（表6）。

2.7 酵母菌生长动态的测定

2.7.1 酵母菌在YPD培养基中的生长动态 4株酵母菌在YPD培养基中均呈指数型生长，24 h时酵母菌浓度达到峰值，24 h后酵母菌浓度保持稳定（图2）。

2.7.2 酵母菌在苹果果实伤口上的生长动态 4株酵母菌均能在苹果伤口上迅速定殖，48 h后基本达到浓度峰值，在以后的7 d中，酵母菌能稳定定殖在苹果伤口上，不易受环境影响，耐受力强（图3）。

2.8 酵母菌株的鉴定

2.8.1 形态学特征 4株酵母菌细胞均呈椭圆形或圆形，椭圆形细胞宽度约为2～3 μm，长度约为4～6 μm，菌落乳白色，光滑湿润，粘稠，容易被挑起。无性生殖均为出芽生殖，没有假菌丝（图4）。

2.8.2 分子鉴定结果 扩增片段大小在500～600 bp（图5），与文献资料[13]的数据相吻合。根据特定DNA片段测序结果进行序列比对和系统发育进化树分析（图6），结合Kurtzman 等[14]的研究结果及形态特征，将4株酵母菌H3、T2、T3、Z8初步鉴定为季也蒙迈耶氏酵母。

3 讨论与结论

目前，防治果实采后病害主要使用化学杀菌剂，虽然化学杀菌剂高效，但易产生安全和质量问题[15]。拮抗酵母菌作为生物防治处理果实采后病害的方法，具有环保、安全的特点，可以替代化学杀菌剂。

苹果果实轮纹病是由贝伦格葡萄座腔菌引起的一种重要的苹果采后病害。目前报道的生物防治苹果轮纹病的方法有很多。例如：Fan等[16]用枯草芽孢杆菌9407产生的芬荠素防治苹果果实轮纹病具有较好的防病效果，10 d时防病效果达57.5%；Gao等[17]用哈茨木霉T88和深綠木霉T95孢子悬浮液田间防治苹果轮纹病取得良好效果；Chen等[18]用解淀粉芽孢杆菌PG12防治苹果果实轮纹病，56 d时的苹果果实轮纹病发病率为50%，空白对照的发病率为100%，高效液相色谱法分析发现解淀粉芽孢杆菌PG12产生的伊枯草菌素A对苹果果实轮纹病的防治具有重要作用。酵母菌防治苹果轮纹病的报道很少，本试验结果表明，从果实和叶片中分离纯化出的酵母菌株H3、T2、T3、Z8在离体筛选与活体防病试验中都具有明显的拮抗效果，形态学和分子生物学初步鉴定，4株酵母菌均为季也蒙迈耶氏酵母[过去名称是季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）]，目前尚未有关于季也蒙迈耶氏（毕赤）酵母防治苹果果实轮纹病的报道。

果实表面和伤口中营养丰富，水分充足，有利于酵母菌的定殖，30株酵母菌大多分离于果实表面和伤口处，其中具有拮抗作用的4株酵母菌均能迅速定殖于苹果伤口处，48 h后酵母菌浓度达到峰值，并能稳定存活在苹果伤口处，与宋聪[19]研究结果一致：酵母菌在培养初期的48 h，前12 h内迅速生长，48 h时达到最高值，此后，数量基本维持在较高水平。酵母菌的接种浓度为1×108 cfu/mL时活体防病效果显著高于浓度为1×104 cfu/mL，酵母菌浓度越高，活体防病效果越好。

综上所述，本试验筛选出的4株季也蒙迈耶氏酵母菌H3、T2、T3、Z8能够在苹果果实上稳定定殖，并对苹果果实轮纹病表现出较好的防病效果，为生防酵母菌在防治果蔬采后病害中的应用提供了依据，但其抑菌防病机理和如何提高防病效果尚需进一步研究。

参 考 文 献：

[1] 张婕. 两种酵母拮抗菌对采后李果实褐腐病的生物防治效果及机理研究[D]. 重庆： 西南大学， 2017.

[2] Zhou T， Northover J， Schneider K E， et al. Interactions between Pseudomonas syringae MA-4 and cyprodinil in the control of blue mold and gray mold of apples[J]. Canadian Journal of Plant Pathology， 2002， 24（2）： 154-161.

[3] Mercier J， Jiménez J I. Control of fungal decay of apples and peaches by the biofumigant fungus Muscodor albus[J]. Postharvest Biology and Technology， 2004， 31（1）： 1-8.

[4] 康玲， 郝红梅， 杨振英， 等. 苹果轮纹病研究进展[J]. 中国农学通报， 2009， 25（9）： 188-191.

[5] Ogata T， Sano T， Harada Y. Botryosphaeria spp. isolated from apple and several deciduous fruit trees are divided into three groups based on the production of warts on twigs， size of conidia， and nucleotide sequences of nuclear ribosomal DNA ITS regions[J]. Mycoscience， 2000， 41（4）： 331-337.

[6] Janisiewicz W J， Roitman J. Biological control of blue and gray mold on apple and pear with Pseudomonas cepacia[J]. Phytopathology， 1988， 78（12）： 1697-1700.

[7] 方中达. 植病研究法[M]. 第3版. 北京： 中国农业出版社， 2001.

[8] Janisiewicz W J， Usall J， Bors B. Nutritional enhancement of biocontrol of blue mold on apples[J]. Phytopathology， 1992， 82（12）：1364-1370.

[9] 王晨， 张殿朋， 南立军， 等. 桃褐腐病菌拮抗酵母的筛选、鉴定及其抑菌活性初探[J]. 中国酿造， 2017， 36（5）：63-66.

[10] 焦红茹. 不同酿酒葡萄品种相关酵母菌的分离及分类鉴定[D]. 杨凌： 西北农林科技大学， 2008.

[11] 商敬敏. 蓬菜、德钦产地葡萄酒相关酵母的分离鉴定及其耐受性研究[D]. 济南： 山东轻工业学院， 2012.

[12] Altschul S F， Madden T L， Schaffer A A， et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST： a new generation of protein database search programs[J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（17）： 3389-3402.

[13] 趙丽丽， 陈存社， 郭凤莲. 26S rDNA序列分析法鉴定酵母菌[J]. 中国酿造， 2008（15）： 49-51.

[14] Kurtzman C P， Suzuki M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella， Meyerozyma， Millerozyma， Priceomyces and Scheffersomyces[J]. Mycoscience， 2010， 51（1）： 2-14.

[15] Qin G Z， Tian S P， Xu Y， et al. Combination of antagonistic yeasts with two food additives for control of brown rot caused by Monilinia fructicola on sweet cherry fruit[J]. Journal of Applied Microbiology， 2006， 100（3）： 508-515.

[16] Fan H Y， Ru J J， Zhang Y Y， et al. Fengycin produced by Bacillus subtilis 9407 plays a major role in the biocontrol of apple ring rot disease[J]. Microbiological Research， 2017， 199： 89-97.

[17] Gao K X， Liu X G， Liu Y H， et al. Potential of Trichoderma harzianum and T. atroviride to control Botryosphaeria berengeriana f. sp. piricola， the cause of apple ring rot[J]. Journal of Phytopathology， 2002， 150（4/5）： 271-276.

[18] Chen X Y， Zhang Y Y， Fu X C， et al. Isolation and characterization of Bacillus amyloliquefaciens PG12 for the biological control of apple ring rot[J]. Postharvest Biology and Technology， 2016， 115： 113-121.

[19] 宋聪. 果实采后病害拮抗菌的分离筛选及其抑菌效果的研究[D]. 重庆： 重庆大学， 2007.