益母草碱调控成纤*维细胞内EGF蛋白表达及对乳腺癌细胞增殖的影响

★ 肖亮 杨军平 黎秋如 王莹*（.江西中医药大学附属医院检验科 南昌 330006；.樟树市中医医院检验科 江西 宜春 3300）

据流行病学研究表明，乳腺癌已成为女性患病率最高的恶性肿瘤之一。最近几年来，乳腺肿瘤相关的基质成纤维细胞介导乳腺肿瘤的发生、转移及潜在治疗靶点已成为基础研究的新热点。肿瘤微环境中，乳腺基质成纤维细胞可被转化和激活成肿瘤相关成纤维细胞［1-2］，随后分泌大量活性因子维持乳腺肿瘤微环境的内部状态、调控乳腺肿瘤的发生［3］、发展及迁徙［4-5］。而在乳腺肿瘤微环境内，表皮生长因子（EGF）早已被证实与基质成纤维细胞转化为肿瘤相关成纤维细胞密切相关［6-7］。

中医药学从古至今，在治疗和预防乳腺疾病包括乳腺肿瘤等方面都具有非常重要的作用［8-9］，现代医学也证实益母草对乳腺癌具有抑制功效［10-11］。

本研究通过建立成纤维细胞（ESF-1）与乳腺癌细胞（BT474）体外共培养模型，益母草碱（leonurine）干预后，观察ESF-1细胞内表皮生长因子（EGF）的表达及对BT474细胞增殖的影响，希望为益母草的临床应用提供科学依据，也为乳腺肿瘤的临床治疗与基础研究开拓新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本实验为细胞生物学体外实验，人乳腺导管癌细胞株（BT474）购买于中科院（上海）生命科学研究院细胞中心（No.TCHu143）；人表皮成纤维细胞（ESF-1）购买于中科院（北京）基础医学研究所细胞中心（No.3111C0001-CCC000108）；实验于2017年1月—2018年5月于江西中医药大学附属医院实验室内完成。

1.2 仪器与试剂 Transwell共培养小室（0.4um）购自于Fisher Scientific公司；快速总RNA提取试剂盒套装购自于Generay公司；逆转录试剂盒Fast Quant RT Kit（with gDNase）购自于TIANGEN公司；qPCR试剂IQ SYBR Green Supermix购自Bio-Rad公司；DMEM-H培养基购自于GIBCO公司；EGF引物购自于上海吉玛生物公司；Human EGF ELISA Kit购自于R&D Systems公司；cck-8试剂盒购自于日本同仁公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞共培养 利用通透性佳的Transwell小室，将ESF-1细胞和BT474细胞分别均匀接种于小室的上下两面，因培养液的相互流动从而达到细胞共培养的目的。见图1。

图1 细胞共培养

1.3.2 实验分组及益母草碱药物干预 取处于对数生长期 ESF-1细胞接种于下室、BT474细胞接种于上室；实验分组为ESF-1组，ESF-1/BT474共培养组，ESF-1/BT474药物干预组（ESF-1/BT474+leonurine）；待接种细胞贴壁后，药物干预组加入益母草碱浓度为10umol/孔，药物浓度参考于相关文献［12］及前期基础实验。

1.3.3 ESF-1细胞中表皮生长因子（EGF）表达的检测 各实验组细胞共培养或单独培养24h、48h后，利用qRT-PCR方法测定ESF-1细胞中EGF mRNA的水平。EGF引物为：上游5' CAA AAC GCCGAAG ACT TACC 3'；下游 5' GAC CAT CCA GAG CCA GACAC 3'；共培养或单独培养48h、72h后，利用ELISA方法测定细胞培养液中EGF的蛋白浓度。

1.3.4 CCK-8法检测BT474细胞增殖 取处于对数生长期的ESF-1细胞及BT474细胞分别接种在Transwell小室的上下面，实验分组为BT474组、BT474药物干预组（BT474+leonurine）、ESF-1/BT474共培养组、ESF-1/BT474药物干预组（ESF-1/BT474+leonurine），均匀铺呈，每孔约2×105个/mL，培养或共培养24h、48h、72h后，CCK-8法检测BT474细胞增殖。

1.4 统计学处理 利用SPSS Statistics 17.0软件统计包进行实验数据处，利用均数±标准差表示实验结果；利用t检验及多重方差分析两组别之间的差异，P＞0.05为无显著差异，P＜0.05为显著差异；PCR数据采用 Bio-Rad CFX Manager软件分析。

2 结果

2.1 ESF-1细胞内EGF的表达水平

2.1.1 各实验组ESF-1细胞内EGF mRNA的表达水平 各实验组培养或共培养24h、48h后，利用qRT-PCR检测ESF-1细胞内表皮生长因子（EGF）mRNA的相对表达水平。见表1。相对于ESF-1实验组，ESF-1/BT474共培养组中ESF-1细胞内EGF 的mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）；而相对于ESF-1/BT474共培养组ESF-1/BT474药物干预组（ESF-1/BT474+leonurine）中，ESF-1细胞内EGF的mRNA的表达水平明显下降，具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 24h、48h后各实验组EGF mRNA相对表达水平（2-ΔΔCt）

2.1.2 各实验组细胞培养液内EGF蛋白的表达 单独培养或共培养48h、72h后，利用ELISA方法检测各实验组细胞培养液内表皮生长因子（EGF）的浓度水平（表2）。相对于ESF-1组，ESF-1/BT474共培养组细胞培养液内表皮生长因子（EGF）浓度表达显著升高（P＜0.05）；而相对于ESF-1/BT474共培养组ESF-1/BT474药物干预组（ESF-1/BT474+leonurine）中细胞培养液内表皮生长因子（EGF）浓度明显下降，具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 48h、72h后各组培养液内EGF浓度

2.2 益母草碱对乳腺癌BT474细胞增殖的影响单独培养或共培养24h、48h、72h后，利用CCK-8法测定各实验组中BT474细胞的增殖情况。见表3。单独培养或共培养24h，各实验组BT474细胞增殖情况未见显著差别（P＞0.05）；培养或共培养48h后，相较于BT474组，各实验组BT474细胞增殖情况也无显著差别（P＞0.05），但相较于BT474药物干预组（BT474+leonurine），ESF-1/BT474组内BT474细胞增殖加快，具有统计学（P＜0.05）；培养或共培养72h后，相较于BT474组，BT474药物干预组（BT474+leonurine）内BT474细胞增殖减少有明显差别（P＜0.05）；相较于ESF-1/BT474组，ESF-1/BT474药物干预组（ESF-1/BT474+leonurine）内BT474细胞增殖减少有明显差别（P＜0.05）。

表3 各组BT474细胞增殖情况（OD值）

3 讨论

益母草在临床上应用广泛，相关研究早已证实益母草对乳腺癌具有抑制功效［10-11］，其主要药效物质益母草碱具有多种生物学功能，可通过下调肿瘤坏死因子TNF-α、诱导型一氧化氮合酶iNOS的表达并且上调核转录因子NF-κB、细胞外信号调节激酶ERK的表达，从而对乳腺炎发挥明显的抗炎作用［13］；益母草碱还能通过调控ROS的水平及NF-κB、MMP-2、TNF-α的表达发挥减少急性肾损伤［14］、抗细胞纤维化［15］、抗炎症［16］等多种生物学功能。

表皮生长因子（EGF）是一种单链多肽，含有53个氨基残基，能通过结合EGF受体启动一系列的信号传递从而调控细胞的增殖、分化、凋亡等生物学功能，并且与肿瘤细胞的发生、发展密切相关［17］。

本实验利用细胞共培养技术，探讨与乳腺肿瘤细胞共培养环境中，成纤维细胞内表皮生长因子（EGF）的变化及益母草碱干预的效果。实验结果提示，与ESF-1细胞单独培养相比，ESF-1/BT474共培养组成纤维细胞ESF-1内EGF的mRNA、蛋白水平表达均升高，实验结果说明，与乳腺肿瘤细胞共培养能上调成纤维细胞内EGF蛋白的表达；另与ESF-1/BT474共培养组比较，ESF-1/BT474药物干预组（ESF-1/BT474+leonurine）中ESF-1细胞内mRNA、蛋白表达明显减少，说明益母草碱能有效抑制共培养环境中成纤维细胞ESF-1内EGF的表达。

本实验还通过CCK-8法测定了各研究组中乳腺肿瘤BT474细胞的增殖情况。单独培养或共培养24h后，各实验组BT474细胞增殖情况未见明显差别，可能因为时间过短，乳腺癌BT474细胞还大都未进入对数增殖期；培养或共培养72h后，相较于BT474组，BT474药物干预组（BT474+leonurine）内BT474细胞增殖减慢（P＜0.05），说明益母草碱能有效抑制乳腺癌BT474细胞的增殖；培养或共培养48h后，相较于BT474药物干预组（BT474+leonurine），BT474组内BT474细胞增殖无明显差别（P＞0.05），，可能益母草碱药物作用还未完全显现，但与之相比，ESF-1/BT474组中BT474细胞增殖有明显差别（P＜0.05），说明与益母草碱能够抑制乳腺癌BT474细胞的增殖不同，EGF可能与乳腺癌BT474细胞的增殖具有正相关性。

4 结论

综上结果，本次实验通过利用细胞共培养模型，研究乳腺癌细胞与成纤维细胞的相互影响及益母草碱的干预效果。实验结果显示与乳腺肿瘤细胞共培养，能上调成纤维细胞内EGF的表达，同时与乳腺肿瘤细胞的增殖可能具有正相关性；且实验结果还显示，益母草碱能下调成纤维细胞内EGF的表达并抑制乳腺肿瘤细胞的增殖。这为本实验团队研究共培养环境中，益母草碱调控成纤维细胞的转化提供了非常有力的支持，也为益母草在乳腺肿瘤的临床治疗上提供新的参考和理论依据。