医学生物化学综合性实验改革的设计与探索

王慧莲，吕社民，马 捷，李冬民

(西安交通大学 基础医学院,陕西 西安 710061)

生物化学是高等院校医学生重要的基础课之一。其实验课的教学是该课程教学重要的组成部分,它在巩固学生的课堂理论知识、训练学生基本实践操作技能、培养学生严谨求实的科学精神、增强学生综合分析问题和解决问题的能力等方面均起着极其重要的作用[1-2]。近年来,随着现代生物化学理论和技术突飞猛进地发展,它的相关理论与技术已经日新月异地应用到生命科学包括临床疾病诊断、治疗和研究中,培养具有扎实生物化学理论知识和实践技能的医学生,提高他们今后职业水平是该课程理论和实验教学的最高目标。因此,这就要求医学生物化学教学要与时俱进,在培养学生基本操作技能的同时,还要注重学生创新思维能力和综合实践能力的培养。

然而,以往生物化学实验的教学中,偏重基础和验证性的实验,实验内容单一且没有系统性,不能充分地调动学生创造力的发挥和个性的发展。随着高校教学改革的不断深化,生物化学综合性实验越来越凸显其必要性和重要性[3],它在学生充分掌握生物化学基本原理的基础上,将教学与科学研究相结合,综合运用先进的实验技术和方法,进行一个相对完整的科学研究。它具有综合性、设计性和探索性的特点[4-5]。因此,本文结合多年科研和生物化学实验教学的实践经验,以综合型实验设计为主线,从培养全面发展的创新型医学人才角度出发,对医学生物化学实验教学改革进行了开拓性的探索。

1 医学生物化学实验教学的现状与问题

目前医学生物化学教学仍然沿袭传统的以理论教学为主,实验教学为辅的学科型模式[6]。依附于理论教学的实验教学,其教学的内容单一,偏重于对课堂理论的验证性实验,而忽略了对学生动手能力和综合创新能力的培养。以西安交通大学医学院为例,传统生物化学实验的内容主要是蛋白质理化性质及其含量测定、蛋白质分离、酶活性的测定、酶动力学实验、生物氧化和维生素C的定量测定等7个实验。这些实验内容主要围绕生物化学理论课内容而设,彼此之间相对独立,内容重复、单一,缺乏知识的连贯性和技术方法的综合应用。

为了提高学生的实验技能,改善生物化学实验课的教学质量,从2006年起学院将原有验证性实验项目进行了压缩,保留3个经典实验,如蛋白质的含量测定、血清蛋白分离和酶动力学实验,增设了一个综合性实验项目:“卵清粘蛋白的提取、分离和纯化”。这次实验内容的改革,通过综合性实验项目,学生利用抽滤、透析、pH值的调试、柱层析和冷冻干燥等综合性实验手段,最终从几枚鸡蛋中分离、制备出卵清粘蛋白的干粉。与验证性实验相比,综合性实验极大地提高了学生对生物化学理论和技术在生产实践中应用的认识。通过系统、连续性的实验,既培养了学生生物化学实验的基本技能,也提高了他们的科研思维能力。

十年的教学实践表明实验教学效果有了显著的提高,但仍然存在下面问题:1)实验内容中陈旧、简单的验证性实验项目所占比例过高；2)验证性实验和综合性实验项目存在重复；3)实验内容单薄,缺乏设计性实验；4)对综合性实验投入的力度不够等,导致学生对生物化学实验课缺乏积极性和主动性。因此,为了适应培养高素质创新型医学人才的需求,本文对医学本科生综合性生物化学实验项目进行了再次改革与探索。

2 综合性实验改革的设计与探索

综合性实验是与传统的实验教学模式有着根本区别的一种新的实验教学模式,它修正和突破了传统实验教学模式中存在的不足和束缚,旨在培养学生的实验综合与应用能力、理论与实际相结合的能力和创新研究能力等,充分突出了学生的主体作用并调动了学生的实验积极性,能够让学生循序渐进地、系统地掌握知识[7]。因此,基于生物化学实验与科研密切结合的特点,团队以正在开展的科研项目为依托,围绕上述生物化学综合性实验的目标,按照实验内容复合性、实验方法多元性、实验手段多样性、人才培养综合性的要求,秉承互补、交融、渗透、承前启后、递进的原则[8],设计出了题为 “非酒精性脂肪肝病与血脂水平、转氨酶活性和清蛋白表达水平变化的相关性研究”的综合性实验。

2.1 综合性实验设计的目的

非酒精性脂肪性肝病是世界范围内最常见的肝脏疾病之一,被认为是代谢综合症的肝脏表现,由于脂肪在肝细胞内过多沉积所引起的肝病[9-10]。目前,临床脂肪肝病检测主要依据血脂指标,如甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC),以及肝功能生化指标,如丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性的变化。与正常健康人相比,脂肪肝病人血清中的TG和TC水平升高,反映早期急性肝损伤程度的肝特异性酶——ALT和AST活性升高[11-12],还有体内最丰富的循环蛋白——清蛋白和凝血因子的合成减少[13]。

因此,本文以SD大鼠脂肪肝模型动物为实验材料,设计出了题为 “非酒精性脂肪肝病与血脂水平、转氨酶活性和清蛋白表达水平变化相关性的研究”综合性实验。其目的就是以正常 SD大鼠为对照,通过大鼠脂肪肝模型的构建、血脂(TG和TC)浓度的测定、转氨酶(ALT和AST)活性的测量、血清和肝脏组织中清蛋白质水平的检测,及各种数据相关性的统计分析,探讨血清TG和TC水平、ALT和AST活性和清蛋白表达水平的变化与非酒精脂肪肝病之间的关系,以期探究脂肪肝的病理机制。随着上述实验内容有序、连续、系统地展开,教学内容与临床紧密联系,既激发了学生的学习兴趣,又提高了学生科研思维、分析和解决问题的能力。同时,也让医学生通过实验教学的教育和培养,能更好地把书本上学到的理论知识应用到实际中去,为培养新世纪创新医学人才打下基础。

2.2 综合性实验的内容

如图1所示,本综合性实验包括如下内容:大鼠脂肪肝模型的构建、血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)浓度的测定、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性检测、大鼠肝脏总蛋白提取及含量测定、清蛋白表达水平检测和数据统计分析。

图1 综合性实验内容

2.3 综合性实验的方法

2.3.1 大鼠脂肪肝动物模型的构建

按改良的文献[14]方法构建大鼠脂肪肝动物模型,具体方法如下:将20只SD大鼠随机分为两组,A组(对照组)给予基础饲料喂养6周,B组(模型组)给予高脂肪饲料(基础饲料89.3%,猪油6%,胆固醇4%,猪胆盐0.5%,丙硫氧嘧啶0.2%)喂养6周；6周内观察两组大鼠一般情况及体重变化,6周后下腔静脉采血4～5 ml,37℃ 恒温60 min,1 500 r/min离心5 min,取血清置于EP管中,-70℃ 冰箱保存,以备血脂和肝功能生化指标等的检测。同时取出大鼠肝脏-80℃冰箱或液氮中保存以备肝脏清蛋白表达水平的检测。

医学院校生物化学实验一般都是在大学二年级开设,实验小组有16～20名学生。因此,在脂肪肝动物模型构建过程中,教师可以指导学生参与整个的建模过程,以激发他们后续实验的热情和科学研究的思维。

2.3.2 血清中TG和TC含量的测定

用甘油三酯(TG)测定试剂盒和总胆固醇(TC)测定试剂盒的指导说明书,分别测定正常SD大鼠(n-10)和脂肪肝大鼠(n＝10)血清TG和TC的含量。在具体实验操作上,将学生分组:如一个20人的小班,可以分成4组(每组有5人,实验样品5份),每组实验测定的样品和内容都不一样,如1组测定正常动物的血清TG含量,2组测定模型动物血清TG含量,3组测定正常动物的血清TC含量,4组测定模型动物血清TC含量。最后,汇总小班实验数据进行统计分析,比较脂肪肝动物血清TG或TC水平与正常健康动物血清TG或TC水平的差异,探究动物血清TG与TC水平与脂肪肝病的相关性。

2.3.3 血清ALT和AST活性的测定

用丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒的指导说明书,分别测定正常SD大鼠和脂肪肝大鼠血清ALT和AST的活性。最后,汇总小班实验数据进行统计分析,比较脂肪肝动物血清ALT或AST活性与正常健康动物血清ALT或AST活性的差异,探究动物血清ALT或AST活性与脂肪肝病的相关性。

虽然,在动物血清TG或TC含量和ALT或AST活性检测的实验,用的都是商品生化试剂盒,但每个试剂盒的测定原理,以及每种试剂在实验中的作用,都需要学生在课前通过自查资料自学。通过这种方式,加深了学生对实验原理的理解,培养学生的自学能力。

2.3.4 肝脏组织总蛋白的提取

本实验用 RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液提取大鼠肝脏组织的总蛋白,以备蛋白质定量和后续清蛋白水平检测实验的材料。具体实验步骤,要求学生查阅资料自行设计。

2.3.5 蛋白质定量

蛋白质的定量分析是生物化学最常涉及的分析内容,是临床上疾病诊断及检查康复情况的重要指标。在生化实验中,对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析,是非常关键的步骤。蛋白质的含量检测有许多种方法,最常用的如双缩脲法(biuret法)、改良的简易folin-酚试剂法、考马斯亮蓝法(bradford法)等。在本综合性实验中,由于涉及两种不同的实验材料(大鼠血清和肝脏组织总蛋白提取液),可以鼓励学生通过查阅资料、讨论等方式自行选择实验的方法,并要求一个小班要采取2～3种不同的蛋白质含量测定方法,每小组用其中一种方法进行测定。然后,根据全班同学所得的实验数据,比较不同蛋白质含量测定方法的灵敏度和优缺点。一方面丰富了学生的实验内容,提高了他们的实验技能,同时也增强了学生实验技术方法学上的知识,激发了他们创新思维能力,为以后的临床工作和科研打下基础。

2.3.6 脂肪肝大鼠清蛋白表达水平的检测

清蛋白又称白蛋白,一类分子较小,呈球状,能溶于水的蛋白质。血清白蛋白是血清中含量最丰富的蛋白质,占血清总蛋白量的50%以上。血清白蛋白在维持血液正常渗透压中起着非常重要的作用。此外,它还具有结合和运输功能,如血清白蛋白可以作为脂肪酸的载体参与运送脂肪酸[15]。此外,血清和血浆白蛋白含量可作为诊断某些疾病的指标。为了开拓学生的科研思维,提高他们分析问题和解决问题的能力,增强学生生物化学实验技能,本实验目的是以正常健康大鼠为对照,从血清和肝脏组织两种不同的层面,通过对脂肪肝大鼠血清和肝脏清蛋白浓度的测定比对,在蛋白质水平上探究脂肪肝对清蛋白表达水平的影响。

因此,在实验设计时,采用两种不同的实验材料和两种不同的方法进行:即用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法对脂肪肝大鼠血清中清蛋白水平进行检测；用免疫印迹(western-blotting)法对脂肪肝大鼠肝脏组织中清蛋白表达水平进行测定。虽然ELISA法和western-blotting法的基本实验原理是一样的,即都是用酶标抗体检测目的抗原(蛋白),显色后比较颜色深浅进行蛋白定量,因此灵敏度也是一样的。但不同之处是在于western-blotting法可以检测组织和胞内的蛋白,结果可以通过图片的形式展示；而ELISA法主要用于检测上清中的蛋白,如血清或上清中抗体的含量。

用ELISA法对脂肪肝大鼠血清中清蛋白水平进行检测的方法如下:取SD脂肪肝大鼠和对照组的血清,按照标准的ELISA法测定步骤测定血清中清蛋白的浓度。具体的实验操作方法由学生在课前查阅资料,通过教师与学生充分讨论后,制定实验方案。另外,按照标准的western-blotting实验操作流程对脂肪肝大鼠肝脏组织中清蛋白表达水平进行检测,即通过一系列连续性的实验操作:聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白、转膜、非特异性位点的封闭、一抗二抗的免疫反应、显色、目的蛋白条带的灰度扫描,对照样品之间的灰度比对分析等,让学生掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹反应的基本原理和操作方法,幷结合实验结果、生物化学知识和文献资料探究脂肪肝病对清蛋白表达水平的影响,以期揭示脂肪肝病的病理机制。同时,也培养了学生动手能力、分析和解决问题的能力、科研思维能力和团队合作精神。

2.3.7 数据统计分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,正态计量资料采用“x±s”表示；2组正态计量数据的组间比较采用t检验；计数资料用例数(n)表示,计数资料组间率(%)的比较采用 χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

生物统计学是生物学领域科学研究和实际工作中必不可少的工具,在生物化学和分子生物学迅速发展的今天,生物统计学更显示出了它的重要性。它是生物学研究者检验假说、寻找模式、建立生物学理论的有力工具,也是生物学研究者探索微观和宏观生物世界的必备基础知识。因此,在本综合性大实验中,学生通过大量的数据统计分析,提高他们对数据分析软件的操作、数据分析和对实验结果的综合分析能力。

3 改革实验课考核模式，提高学生的综合素质

传统实验课的考核方式主要依据出勤率和实验报告给出学生的实验成绩,而学生的实验报告实际上很难反映他们真实的实验操作能力和综合素质。由于实验结果直接、单一,互相抄袭实验数据甚至实验报告的现象在学生中比较严重。另外,实验报告的撰写格式千篇一律。一般都是照抄书本上的实验原理、步骤和操作方法,然后展示结果就可以完成。很少有学生对实验结果进行分析、讨论或给出自己对实验的改革建议。因此,很难利用撰写实验报告方式,加深学生对理论知识和实验技术的理解和记忆,提高他们科研思维能力和论文写作能力。

而本综合性实验项目,实验内容丰富,实验流程和技术交错复杂,实验过程中所涉及生物化学理论知识和临床实践知识点多且广泛,其中许多实验都需要学生自己查阅大量的文献资料。同时,教师与学生、学生与学生之间还要借助课堂和现代信息交流平台(微信,微课等),经过广泛地讨论后才能设计出具体的实验步骤。另外,由于实验材料是大鼠,实验的结果是全部同学各自实验结果的汇总,这就可能使得实验结果有一些不确定性和多样性。因此,为了鼓励学生在实验报告中突出自己的创造性见解和认识,培养学生积极思考,勇于探索的学习习惯,在老师指导下要求学生提交论文式的实验报告。具体格式包括:题目,前言,实验材料与方法,实验结果与讨论,参考文献。学生经历了从立题、资料查阅、实验步骤的设计、实施、实验数据处理、结果分析、论文书写的全过程,这样既可以激发学生的主观能动性,培养学生严谨的科学态度,扩展学生理论知识和实验技能的深度,也加强了学生对实验中所出现问题的分析讨论和文字表达能力,为以后撰写科研论文打下良好的基础。

教师在评阅学生实验论文时,要从如下5个方面进行评分:

1)学生对综合性实验项目中所涉及的知识和技术理解和概述的优劣程度；

2)学生对实验材料、实验流程及方法描述的准确程度；

3)学生对实验结果描述的清晰和准确程度；

4)学生对实验结果理解、分析和引用文献讨论的优劣程度等；

5)文中引用文献的准确与否。对于写的优秀的学生,经老师修改和完善后,鼓励他们公开发表。学生最终的实验成绩＝实验操作能力(30%)＋实验设计和问题解决能力(30%)＋实验报告论文(40%)。

4 结束语

总之,与临床实践紧密联系的综合性教学方法,为当代医学教育拓展了新的实验教学模式,通过多方位多层次的理论与实践有机结合,真正地提升了实验教学的质量和水平,训练了学生的初步科研能力。因此,设计这项教学与科研相结合的生物化学综合性的大实验,希望通过这个实验项目的开展,提高学生的科研思维和创新能力,培养适应社会发展的创造型医学人才。