甲状腺乳头状癌组织中CELF1表达及其功能研究

金沅武，赵 媛

(山东省淄博矿业集团有限责任公司中心医院 肿瘤血液科，山东 淄博 255120)

乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最为主要的甲状腺癌病理学类型，约占90%以上，具有多灶性生长及局部淋巴结转移的特点，是导致部分患者复发及预后不佳的主要因素[1]。CELF1也称为CUG连接蛋白1(CUG-binding protein 1，CUGBP1)，是RNA连接蛋白CELF家族重要成员之一，在调控mRNA翻译、降解过程中发挥关键性作用[2]，近年来研究发现其与恶性肿瘤发生、进展关系密切，与非小细胞肺癌患者不良预后有关[3]，参与了膀胱癌BIU-87细胞增殖和侵袭过程[4]。本研究拟分析PTC组织中CELF1表达，并探讨其对PTC细胞增殖和侵袭能力的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年3月～2016年12月在我院择期行根治性手术治疗的PTC患者78例，纳入标准：①首发初次手术；②术前未接受任何治疗；③术后病理检查确诊为PTC。男29例，女49例，年龄30～65岁，平均年龄(47.8±10.4)岁。将手术中获得的PTC组织及癌旁组织用甲醛固定，石蜡包埋保存。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者或家属均知情同意。

1.2 主要试剂和设备 免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物，兔抗人CELF1多克隆抗体购自美国Abcam，人PTC细胞株TPC-1购自上海拜力生物科技公司，DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，Lipofectamin 2000转染试剂盒、总RNA提取试剂盒(Trizol法)购自美国Invitrogen公司，CELF1干扰序列及对照序列均由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，CELF1和内参引物由上海生工生物公司设计合成，CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自上海拓然生物科技公司，Transwell小室、Matrigel基质胶购自美国BD公司，荧光定量PCR仪购自美国ABJ公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化法检测PTC组织和癌旁组织中CELF1蛋白表达 取石蜡包埋组织，切片、脱水，浸入柠檬酸盐中高压抗原修复，用3%过氧化氢封闭。加入一抗兔抗人CUGBP1多克隆抗体(1∶800稀释)，4℃过夜孵育，次日复温1 h，PBS冲洗3次，加入通用型二抗，室温下孵育60 min，PBS冲洗3次，二胺基联苯胺显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。PBS代替一抗作为对照，光学显微镜观察。结果判定：高倍镜下随机取10个视野，按照半定量法对结果进行判定[5]，①染色强度：0分无色；1分淡黄色；2分棕黄色；3分黄褐色；②阳性细胞比例：0分≤5%；1分6%～25%；2分26%～50%；3分51%～75%；4分>75%；③将两项评分相乘，≤1分为阴性(-)，>1分为阳性(+)。

1.3.2 细胞培养及分组 用DMEM培养基(含10%胎牛血清)对TPC-1细胞进行培养，培养条件：5% CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱。取对数生长期细胞，胰酶消化，传代培养，待细胞融合度达80%左右时进行分组转染，①CELF1干扰序列组，转染CELF1基因的干扰序列：5′-GAGCCAACCUGUUCAUCUA-3′；②对照序列组，转染干扰序列的对照序列：5′-AAAGGACGGAGGACATTAT-3′；③空白组，不作任何处理。各组转染后继续培养，完成后续实验。

1.3.3 实时荧光定量PCR技术检测细胞中CELF1表达 转染后培养48 h时，取各组细胞，用Trizol试剂对总RNA提取，并分析总RNA浓度，以A260/A280 1.80～2.10为合格，将合格样品逆转录为cDNA，保存于-20℃备用。按照PCR试剂盒说明进行引物扩增，引物序列，CELF1，上游：5′-GCUUUGGUUUUGUAAGUUA-3′；下游：5′-GGCUUAAAGUGCAGCUCAA-3′；GAPDH，上游：5′-TGATGGTACATGACAAGGTGC-3′，下游：5′-ACAGTCCATGCCATCACTGC-3′。PCR条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，70℃ 30 s，连续循环扩增38次，利用2-△△Ct获得各组细胞中CELF1 mRNA相对表达量。

1.3.4 CCK-8法检测细胞增殖能力 取各组转染培养48 h细胞，接种至96孔板，调整密度为2×103个/孔，每组设3个复孔，置于恒温培养箱中贴壁培养4 h。待细胞贴壁后，于培养12、24、48、72、96 h时，分别将CCK-8液10 μL加入各孔，恒温孵育培养3 h。用酶标仪取450 nm波长处测定吸光度A值。

1.3.5 克隆形成实验检测细胞增殖能力 取各组转染培养48 h细胞，制备单细胞悬液，取约500个细胞接种在培养皿中培养14 d至肉眼见到有克隆形成止。除去培养液，加入4%多聚甲醛，固定25 min，PBS冲洗3次，结晶紫染色25 min，用低倍显微镜观察，以超过50个细胞为1个克隆数，计算克隆形成率(%)=克隆数/接种细胞数×100%，重复实验3次。

1.3.6 Transwell小室检测细胞侵袭能力 将Matrigel基质胶稀释后平铺于Transwell小室，37℃风干后使用。将培养48 h细胞消化后，制备细胞悬液，取约2×105个细胞加入到小室上室，将含有20%胎牛血清的培养液约500 μL加入小室，放在恒温培养箱中孵育24 h。将小室取出，除去培养液，PBS冲洗2次，4%甲醛固定，用棉签将未穿膜的散落细胞去除，0.1%结晶紫染色25 min，用倒置显微镜观察。

2 结果

2.1 PTC组织和癌旁组织中CELF1蛋白表达 PTC组织中CELF1蛋白阳性表达率(75.64%)高于癌旁组织(38.46%)，差异有统计学意义(χ2=22.002，P=0.000)，见图1。

2.2 PTC组织中CELF1蛋白表达与临床病理特征相关性 PTC组织中CELF1蛋白表达与TNM分期、侵犯被膜和淋巴结转移有关(P<0.05)，见表1。

A.PTC组织；B.癌旁组织，定位于细胞质，图片标尺为50 μm。

图1 PTC组织和癌旁组织中CELF1蛋白表达

表1 PTC组织中CELF1蛋白表达与临床病理特征的相关性[n(%)]

指标nCELF1蛋白表达+-χ2P年龄/岁 ≥454836(75.00)12(25.00) <453020(66.67)10(33.33)0.6330.426性别 男2921(72.41)8(27.59) 女4935(71.43)14(28.57)0.0090.926肿瘤直径/cm >21814(77.78)4(22.22) ≤26042(70.00)18(30.00)0.4140.520肿瘤数量 单个5843(74.14)15(25.86) 多个2013(65.00)7(35.00)0.6130.434TNM分期 Ⅰ^Ⅱ期5535(63.64)20(36.36) Ⅲ^Ⅳ期2321(91.30)2(8.70)6.1310.013侵犯被膜 是2119(90.48)2(9.52) 否5737(64.91)20(35.09)4.9530.026淋巴结转移 是4339(90.70)4(9.30) 否3517(48.57)18(51.43)16.9090.000

2.3 各组细胞中CELF1基因表达、细胞克隆形成率和细胞侵袭能力 与对照序列组和空白组相比，CELF1干扰序列组细胞中CELF1 mRNA相对表达量降低(P<0.05)，见表2；与对照序列组和空白组比较，CELF1干扰序列组细胞克隆形成率降低(P<0.05)，见表2、图2。与对照序列组和空白组比较，CELF1干扰序列组侵袭细胞数降低(P<0.05)，见表2、图3。

组别CELF1 mRNA相对表达量细胞克隆形成率/%侵袭细胞数/个空白组2.17±0.1475.24±3.53124.96±8.04对照序列组2.20±0.0778.49±5.95122.36±6.07CELF1干扰序列组1.11±0.13ab20.78±4.23ab82.98±8.76abF163.436287.53755.867P0.0000.0000.000

注：与空白组比较，aP<0.05；与对照序列组比较，bP<0.05。

A.空白组；B.对照序列组；C.CELF1干扰序列组。

图2 克隆形成实验检测细胞增殖能力

A.空白组；B.对照序列组；C.CELF1干扰序列组。

图3 Transwell实验检测细胞侵袭能力

2.4 各组细胞增殖能力 与空白组和对照序列组比较 CELF1干扰序列组细胞24、48、72、96 h时吸光度A值均降低(P<0.05)，见表3、4。

组别12 h24 h48 h72 h96 h空白组0.17±0.020.39±0.030.54±0.070.65±0.100.75±0.02对照序列组0.17±0.060.38±0.030.50±0.120.71±0.200.81±0.10CELF1干扰序列组0.14±0.020.25±0.08ab0.29±0.12ab0.38±0.07ab0.51±0.09ab

注：与空白组比较，aP<0.05；与对照序列组比较，bP<0.05。

表4 各组细胞不同时点吸光度A值重复测量方差分析

变异来源DfSSMSF P 分组20.7670.38461.0780.000检测时间2.1873.0681.40387.8260.000分组×时间4.3740.2290.0523.2770.020

注：Mauchly球形检验W=0.134，P=0.002，拒绝球形假设，需校正。

3 讨论

由于PTC发病隐匿，多数患者发现时可能已经存在颈淋巴结转移或远处侵犯[6]，尽管PTC患者5年生存率达95%以上，但仍有部分患者由于肿瘤细胞侵袭力强、细胞分化程度低而预后不佳[7]。CELF1基因位于人染色体11p11上，最初发现在强直性肌营养不良发生中发挥重要作用[8]，随着研究深入，发现其在恶性肿瘤发生中发挥重要作用，在肺癌[9]、口腔鳞癌[10]、胶质瘤[11]等多种恶性肿瘤组织中呈高表达，且与细胞增殖及侵袭力密切相关，亦有研究表明[12]，CELF1高表达可作为预后不良的标志物。本研究结果显示，CELF1蛋白在PTC组织中呈高表达，可能参与了PTC发生过程，且与PTC进展及恶性转移过程有关。

特异性干扰PTC细胞中CELF1基因后，CELF1干扰序列组细胞中CELF1基因表达被成功抑制。有研究指出[13]，CELF1高表达可促进胶质瘤细胞增殖及细胞周期改变。本研究结果显示，CELF1干扰序列组细胞24、48、72、96 h时吸光度A值均低于对照序列组和空白组，且克隆形成实验显示，CELF1干扰序列组细胞克隆形成率较对照序列组和空白组降低，这些结果说明沉默PTC细胞中CELF1基因可减少细胞增殖能力，提示CELF1基因高表达可能参了PTC细胞恶性增殖过程。本研究结果显示，CELF1干扰序列组侵袭细胞数均低于对照序列组和空白组，说明CELF1基因参与了PTC细胞侵袭过程，与细胞侵袭力相关。

综上所述，CELF1蛋白在PTC组织中呈高表达，特异性下调PTC细胞中CELF1基因表达可减少细胞增殖，抑制细胞侵袭力，有望为PTC临床防治提供新的基因靶位。