大鼠尾椎髓核干细胞的分离与分化能力

沈 阳，徐宏光，张 屿，王 效，肖 良，刘 晨，金中行

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 脊柱外科，安徽 芜湖 241001)

下腰痛与椎间盘退变密切相关，在人群中普遍存在。研究表明，超过半数以上的腰部疼痛是由椎间盘退变导致的[1-2]。目前，对于椎间盘退变的治疗仍然以内科治疗为主，其远期疗效并不理想，而对于外科治疗，虽然能快速解决椎间盘退变带来的症状，但是并不能延缓椎间盘退变的病变进程。除此之外，椎间盘由位于中央区域的髓核、外围的纤维环以及上下侧的软骨终板共同组成,作为人体内最大的无脉管结构，细胞主要通过扩散作用汲取邻近椎体血管内的氧气及营养物质，因此来自血液及骨髓的外源性干细胞难以到达椎间盘组织[3]。故椎间盘在长期的上身负荷下易发生退变。也正是椎间盘持续的退变，导致椎间盘内组织水分降低，细胞外基质增加，细胞数目大幅度降低，组织钙化等病理改变[4-5]。

随着干细胞与再生医学的兴起，人们对干细胞的生物特性的了解不断深入，给椎间盘退变的治疗带来了新的希望。如何有效获取干细胞，成为椎间盘退变生物治疗的关键。本文根据前期的研究，改进了髓核组织的消化方法，通过低密度接种培养，获取细胞集落，后通过多向分化及单克隆形成能力检测，验证该细胞集落具有干细胞特性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4周龄SD大鼠10只，雌雄不限，体质量100～200 g，由江苏省南京市青龙山动物研究中心提供。

1.2 实验试剂 0.25%EDTA-胰酶(Gibco)，0.2%Ⅰ型胶原酶(Sigma),青霉素-链霉素溶液(15070063，Gibco)，磷酸盐缓冲液(PBS)(SH30256.01,hyclone)，DMEM/F12培养基(Gibco),干细胞胎牛血清(Gibco)，干细胞成骨分化诱导培养基(A1007201，Gibco)，干细胞成脂肪分化诱导培养基(A1007001，Gibco)，干细胞成软骨分化诱导培养基(A1007101，Gibco)，茜素红染色液(南京森贝伽生物科技有限公司)，油红O染色剂(O0625，Sigma),番红染色液(南京森贝伽生物科技有限公司)，结晶紫染色剂(C8407，索莱宝)，10 cm培养皿。

1.3 实验方法

1.3.1 获取大鼠尾椎髓核原代细胞(nucleus pulposus cells，NPCs) 取4周龄SD大鼠幼鼠10只，给予颈椎脱臼法处死后，全部浸没于75%的酒精10 min，无菌条件下分离大鼠尾椎C1～C5节段，解剖显微镜下分离椎间盘中央部分的髓核组织，将髓核都浸泡在含有双抗的PBS中10 min，取出后PBS冲洗3次，加入0.25%EDTA-胰酶，置于37℃温水浴箱中40 min后离心并弃上清，最后分别加入0.2%Ⅰ型胶原酶和重新置于水浴箱中消化1 h左右，每30 min震荡1次以加速消化。待组织完全消化后用200目滤网过滤，1500 r/min离心5 min，弃上清，重新加入含有10%的FBS培养基吹打混匀，备用。整个获取过程在2 h内完成，以便于更好地保持髓核细胞的活性。

1.3.2 获取大鼠尾椎髓核干细胞(nucleus pulposus stem cells，NPSCs) 将得到的NPCs吹打混匀，chamber计数板计数，按照50、100、200个/cm2的密度接种于10 cm培养皿，每皿加入6～8 mL的含有20%FBS的DMEM/F12培养基，置于37℃，5%CO2的培养箱，每3 d换液1次，培养10 d。显微镜下观察细胞集落的形态。用4%的多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3次后，再使用0.1%的结晶紫染色10 min，观察集落形态，统计集落形成率，倒置相差显微镜下细胞数少于20个的集落忽略不计。

1.4 多向分化能力检测 将上述得到的细胞集落经0.25%的胰蛋白酶消化后进行体外扩增培养，取第2代细胞，按照每孔2×104的密度接种于24孔板，加入1 mL含有10%FBS的DMED/F12培养基，待细胞融合达80%，按如下步骤进行诱导分化。

加入成骨分化诱导培养基，每3 d换液1次，诱导21 d后，4%多聚甲醛固定细胞15 min，加入适量茜素红染液染色30 min后，PBS轻轻冲洗2遍，倒置相差显微镜下观察。

加入成脂肪分化诱导培养基，每3 d换液1次，每次换液时不要把原培养基全部吸出，诱导21 d后，如上方法进行细胞固定，油红O染液染色30 min，然后苏木素复染30 min，PBS冲洗后置于显微镜下观察。

按照micromass法[6]进行成软骨方向分化诱导，加入成软骨分化诱导培养基，每3 d换液1次，诱导21 d，固定细胞，番红染色30 min，冲洗后置于显微镜下观察。

1.5 单克隆形成能力检测 单克隆形成能力反映出细胞的强大增殖能力，据国外文献报道，在接种密度<50个/cm2时[7]，只有具有干细胞性质的细胞，才能得以生存下来。我们将获得的细胞集落使用0.25%的胰蛋白酶消化后，收集细胞悬液，按照50个/cm2的密度接种于10 cm培养皿上，加入8 mL含20%FBS的DMEM/F12培养基，置于37℃，5%CO2的培养箱，每3 d换液一次，培养15 d后，结晶紫染色，观察是否有细胞集落形成。

2 结果

2.1 NPCs与NPSCs形态学比较 NPCs接种后，大约48 h贴壁，形态多不规则，呈三角形或不规则四边形，倒置相差显微镜下可见细胞内部含有较多“空泡”(图1A)。髓核细胞按照不同密度接种培养后，3 d后可见细胞贴壁(图1B)，5 d见贴壁细胞增殖形成细胞集落(图1C)。随着培养时间的延长，10 d时，可见较大形态的细胞集落形成。高倍镜下观察，细胞多呈梭形，内部无“空泡”结构(图1D)。

2.2 多向分化能力 含钙基质可以被茜素红染液染成红色或者鲜红色。在诱导成骨分化4 d，使用多聚甲醛固定细胞后，经茜素红染色，显微镜下可见视野大片被染成深红色含钙骨基质。油红O为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪着色。在成脂肪分化诱导15 d左右，轻轻吸取上清液，多聚甲醛固定，实验组加入适量油红O染色剂，显微镜下可见细胞内有较多透亮的红色脂肪滴。

番红染色原理在于嗜碱性的软骨与碱性染料番红结合呈现红色。在成软骨诱导18 d左右，经番红染色，可见实验组有软骨片被染成深红色。见图2。

A.NPCs呈不规则三角形，内部含有较多“空泡”结构;B～D.髓核细胞按照不同密度接种培养。不同时间内细胞集落的形态变化。B.接种3 d后，可见已经贴壁的细胞增殖形成较小的细胞集落;C.接种培养5 d，细胞集落逐渐变大;D.接种培养10 d，可见均一的呈圆形的细胞集落。

图1 NPCs与NPSCs形态比较

A.成骨方向分化，含钙基质被茜素红染成鲜红色;B.成脂肪方向分化，细胞内脂肪滴被油红O染成亮红色;C.成软骨方向分化，可见大片的软骨基质被染成深红色。

图2 NPSCs三系分化

2.3 单克隆形成能力检测 在进行单克隆能力检测时，高倍显微镜下可见集落中的细胞形态大部分呈规则的梭形，细胞内部无“空泡”。结晶紫染色，肉眼可见被染成紫色的细胞集落。见图3。

3 讨论

近几年随着组织工程学的兴起，干细胞及相关临床转化[8-9]引起人们的高度重视，椎间盘缺乏血供，无神经支配，生理状态下处于长期封闭的腔隙内，因此，椎间盘组织可以逃避细胞免疫及体液免疫，成为“免疫豁免”[10-11]的组织之一。目前向发生退变的椎间盘移植干细胞有两种途径：移植技术及载体。正是椎间盘这种“免疫豁免”的特性，我们可以向椎间盘内直接注射干细胞，在动物模型[12]和人体模型[13]中，这种方法已经被证实对于治疗椎间盘退变有明显作用。但是干细胞直接注射治疗也存在很多缺点，由于干细胞具有多向分化的特性，在注射时若发生泄露，在脊柱峡部会发生骨化而造成椎管狭窄[14]。细胞载体很好地解决了这个问题，载体一方面可以防止细胞泄露，另一方面可以提供干细胞生长的微环境。包括凝胶载体和生物载体，前者包括胶原蛋白凝胶、透明质酸凝胶等，后者包括微球支架[15]和其他生物增强支架[16]等。

A.高倍镜下集落中的细胞形态;B.单克隆形成能力检测，按照不同密度接种培养得到的细胞集落再次进行单克隆后，依然具有低密度形成细胞集落的能力。

图3 NPSCs单克隆形成能力检测

本实验将NPCs低密度接种于培养皿中培养，将获得的细胞集落进行了多向分化诱导和单克隆形成能力检测，可以初步判断通过该法获得的细胞具有干细胞特性，也符合干细胞鉴定标准。当然，本文也存在不足，未进行免疫学鉴定，但是目前关于成体干细胞的研究还属于初步阶段，很多成体干细胞表面的标记物还是未知的，需要我们进一步去完善。NPSCs的分离与鉴定，经过进一步的研究与完善，将有望解决种子细胞来源问题，为今后的组织工程奠定良好基础。