异甘草素对斑马鱼胚胎发育、血管生成和心脏的影响

何俊霖， 于思， 曹治兴， 王雯雯， 张若琪， 李玉芝， 彭成

(成都中医药大学药学院，西南特色中药资源重点实验室，成都611137)

斑马鱼Danioreriovar.是一种重要的脊椎动物模型，其主要生理组织结构、基因遗传、生物信号调控以及疾病特征等与人类相似，在生命科学研究中已经成为被世界广泛关注的主要模式生物之一。另外，斑马鱼具有个体小、繁殖能力强、易于大量养殖、其透明胚胎能够直接观察生理结构变化等多种优点。同时，斑马鱼对测试药物需求量少，是一种非常适用于中药有效成分药理学研究的动物模型(彭蕴茹等，2017)。

异甘草素是一种广泛存在于甘草、黄芪、红芪、滇黄精等中药内的异黄酮类化合物(展翔，2018)，具有多重药理活性，可抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗微生物，对肝以及心血管有一定的保护作用(Zhaoetal.，2015；Gauretal.，2016；Tanigawaetal.，2016；Gaoetal.，2017；Houetal.，2017；Huetal.，2017)。目前，有关异甘草素的体实验研究以啮齿动物为主，而以斑马鱼为模型的研究甚少。本研究以异甘草素作用于斑马鱼胚胎，研究其对斑马鱼胚胎发育、血管生成及其心脏发育的影响，以期为异甘草素的深入研究和开发提供参考价值。

1 材料

1.1 药物与实验动物

异甘草素(批号：YGCS20160418，南京春秋生物工程有限公司)用二甲基亚砜(DMSO，批号：SHBG6226V，美国Sigma-Aldrich公司)配成10 mg·mL-1的紫草素母液，实验时使用含0.001 5%N-苯基硫脲(PTU，批号：BCBK8912V，美国Sigma-Aldrich公司)的斑马鱼胚胎培养液稀释至所需浓度。舒尼替尼购于南京康满林化工实业有限公司(批号：S46150)。

1.2 实验仪器与主要试剂

斑马鱼繁育系统(北京爱生科技发展有限公司)；MGC-100型恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；M165-FC型体式荧光显微成像系统(德国Leica公司)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，批号：M0202A，大连美仑生物技术有限公司)。

2 方法

2.1 斑马鱼胚胎的饲养及获取

斑马鱼为血管绿色荧光标记的Tg(flk1∶GFP)转基因AB品系，由成都中医药大学药学院斑马鱼实验平台自主繁育。饲育条件为：北京爱生斑马鱼繁育系统，全封闭循环，水温28 ℃，室温26 ℃，pH7.2～7.5，电导率500～550 μs·cm-1，光照14 h/黑暗10 h交替。选择生长状态良好的斑马鱼以雌雄比=1∶1进行繁育，用隔板将雌雄分开，于次晨抽去隔板，2 h后收集斑马鱼胚胎，置于28 ℃恒温培养箱孵育。

2.2 斑马鱼胚胎畸形率与存活率的测定

选取受精后10 h、24 h(hours post fertilization，hpf)发育正常的斑马鱼胚胎随机置于24孔板，每孔15枚，将原胚胎培养液吸出，立即加入2 mL浓度梯度分别为4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1、14 μg·mL-1的异甘草素药液，用0.1%DMSO培养液作为溶剂空白对照，放入恒温培养箱中培养，于给药12 h、24 h、36 h、48 h后在显微镜下观察记录胚胎畸形率与存活率，并拍照。每组实验重复3次。斑马鱼胚胎由透明变为白色或在显微镜下观察胚胎开始变模糊判定为胚胎死亡。畸形率计算公式为：畸形率=畸形胚胎数/(胚胎总数-死亡胚胎数)×100%。

2.3 异甘草素对斑马鱼胚胎血管生成的影响

斑马鱼胚胎发育过程中，其节间在10 hpf开始发育，此时血管开始发育，到36 hpf基本发育完全(Kimmeletal.，1995)，故选取10 hpf斑马鱼胚胎研究异甘草素对其血管生成的影响。取10 hpf发育正常的斑马鱼胚胎随机置于24孔板，每孔15枚，将原胚胎培养液吸出，立即加入2 mL浓度梯度为2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、8 μg·mL-1的异甘草素药液，用0.1%DMSO培养液作为溶剂空白对照，并增设1 μg·mL-1舒尼替尼药液作为阳性对照，放入恒温培养箱中培养24 h后取出，注射针脱模后，用1%CMC-Na固定在有凹槽的载玻片上，使其双眼、体节重合，在荧光显微镜下拍摄斑马鱼血管的荧光图像。实验重复3次。

2.4 斑马鱼胚胎心率的测定

斑马鱼胚胎心脏在24 hpf左右开始搏动，72 hpf心脏形态发育基本完成，心脏搏动也逐渐变得强而有力且趋于平稳(Kimmeletal.，1995)，故选择 24 hpf斑马鱼胚胎研究异甘草素对斑马鱼心脏发育的影响。取24 hpf发育正常的斑马鱼胚胎随机置于24孔板，每孔15枚，将原胚胎培养液吸出，立即加入2 mL浓度梯度为2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1的异甘草素药液，用0.1%DMSO培养液作为溶剂空白对照，每12 h记录30 s内的心率，至给药后48 h。实验重复3次。

2.5 斑马鱼胚胎心脏形态的观察

取24 hpf发育正常的斑马鱼胚胎随机置于24孔板，每孔15枚，按2.2方法给药，恒温培养48 h后，用1%CMC-Na固定，在体视显微镜下拍摄心脏形态图像。

2.6 数据处理与统计

3 结果

3.1 异甘草素对斑马鱼胚胎畸形率的影响

异甘草素在≥6 μg·mL-1剂量下可明显导致10 hpf、24 hpf斑马鱼胚胎发生畸形，并随着浓度升高，畸形率升高(图1，图2)。异甘草素对10 hpf斑马鱼胚胎作用24 h后，与空白对照组相比，4 μg·mL-1异甘草素组个别胚胎尾部略显弯曲，8 μg·mL-1异甘草素组脊柱出现轻度弯曲，而12 μg·mL-1异甘草素组尾部严重弯曲(图3)，且随着用药量的增大，斑马鱼胚胎体型也不同程度地变短变小。

3.2 异甘草素对斑马鱼胚胎存活率的影响

异甘草素对10 hpf、24 hpf斑马鱼胚胎存活率的影响见表1、表2，异甘草素浓度为6 μg·mL-1时胚胎开始出现死亡，浓度越大、作用时间越长，胚胎存活率越低，且24 hpf斑马鱼胚胎较10 hpf的存活率降低幅度更大。

图1 异甘草素对10 hpf斑马鱼胚胎畸形率的影响(n=3)Fig. 1 Effect of isoliquiritigenin on the deforming rate of zebrafish embryos at 10 hpf (n=3)

图3 异甘草素作用于10 hpf斑马鱼胚胎24 h对胚胎发育的影响(5×)Fig. 3 Effect of isoliquiritigenin on the growth and development of zebrafish embryos at 10 hpf for 24 h (5×)

箭头指向斑马鱼胚胎畸形部位

Arrows point to the deformed part of the zebrafish embryos

3.3 异甘草素对斑马鱼胚胎血管生成的影响

与空白对照组相比，异甘草素浓度为2 μg·mL-1时即可抑制斑马鱼胚胎血管的生成，且浓度增加，作用越强，当异甘草素浓度为8 μg·mL-1时，侧血管完全被抑制，其抑制作用强于阳性对照组(图4)。

表1 异甘草素对10 hpf斑马鱼胚胎存活率的影响Table 1 Effect of isoliquiritigenin on the survival rate of zebrafish embryos at 10 hpf

注： 与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01； 下同

Notes： Compared with control group，*P<0.05，**P<0.01； the same below

表2 异甘草素对24 hpf斑马鱼胚胎的存活率的影响Table 2 Effect of isoliquiritigenin on the survival rate of zebrafish embryos at 24 hpf

图4 异甘草素作用于10 hpf斑马鱼胚胎24 h对血管生成的影响(5×)Fig. 4 Effect of isoliquiritigenin on the angiogenesis of zebrafish embryos at 10 hpf for 24 h (5×)

3.4 异甘草素对斑马鱼胚胎心率的影响

异甘草素作用于24 hpf斑马鱼胚胎的心率见表3，同一时间点的斑马鱼胚胎，与空白对照组相比，给药组斑马鱼的心率极显著降低，且异甘草素浓度越高，心率越低。空白对照组中，12～48 h斑马鱼胚胎心率呈逐渐增加的趋势，异甘草素浓度为2 μg·mL-1、4 μg·mL-1时，也呈现心率渐增的趋势，而浓度为6 μg·mL-1、8 μg·mL-1时，却出现先降低后升高的趋势，浓度为10 μg·mL-1、12 μg·mL-1时，则呈心率逐渐降低的趋势。

3.5 异甘草素对斑马鱼胚胎心脏形态的影响

与空白对照组相比，给药组斑马鱼胚胎的心包(图5：A中实线圈区域)与卵黄囊(图5：A中虚线圈区域)肿大，且肿大程度呈剂量依赖。此外，当异甘草素浓度为8 μg·mL-1时，胚胎开始出现轻微血液淤滞现象(箭头指示部位)，当异甘草素浓度为12 μg·mL-1时，表现为严重的血液淤滞现象。

4 讨论

异甘草素广泛存在于甘草、黄芪、红芪、滇黄精等多味常用无毒中药。然而，本研究结果显示，异甘草素可影响斑马鱼胚胎的发育，中低剂量对斑马鱼胚胎有一定的致畸性，而高剂量对斑马鱼胚胎产生明显的致畸和致死性。本研究结果所表现出的“毒性”主要是由于本研究所测试异甘草素浓度较高。后续实验结果表明，异甘草素在中低剂量下可表现出明显的抑制血管生成和降低心率的作用，表明其具有一定的安全性。

表3 异甘草素作用于24 hpf斑马鱼胚胎心率的影响(n=10)Table 3 Effect of isoliquiritigenin on the heart rate of zebrafish embryos at 24 hpf (n=10)

图5 异甘草素作用于24 hpf斑马鱼胚胎48 h对心脏形态的影响(8×)Fig. 5 Effect of isoliquiritigenin on the cardiac morphology of zebrafish embryos at 24 hpf for 48 h (8×)

实线圈区域为斑马鱼心包， 虚线圈区域为斑马鱼卵黄囊； 箭头处为斑马鱼血液淤滞部位

Real coil area is zebrafish’s pericardium， and imaginary coil area is zebrafish’s saccus omphaloentericus； arrows point to stagnant part of the zebrafish blood

血管生成一般是在已有血管的基础上，由血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成等一系列步骤组合的生物学过程(Vandekeereetal.，2015)。研究表明，血管异常生成是癌症、炎症、老年黄斑变性等疾病的主要促进因素，目前已有舒尼替尼、贝伐单抗等多种血管生成抑制剂用于相关疾病的治疗(Carmeliet & Jain，2000；Yadavletal.，2015)。本研究以舒尼替尼为阳性对照，证实了异甘草素可显著抑制斑马鱼胚胎血管的生成，异草甘素浓度为2 μg·mL-1时可显示出抑制作用。已有研究报道，异甘草素对膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、胃癌以及其他多种癌细胞具有一定的抗肿瘤活性(Linetal.，2016；Gaoetal.，2017；Huangetal.，2017；Moreno-Londonoetal.，2017；Zhangetal.，2018)。异甘草素可呈剂量依赖型抑制VEGF/VEGFR-2以及MAPK信号通路抑制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、管状形成、侵袭和迁移能力，进而发挥抗肿瘤作用(Kangetal.，2010；Wangetal.，2013)。因此，推测本研究中异甘草素主要以抑制内皮细胞生成、迁移和管状形成的形式抑制血管生成。

心率是反映心脏功能的重要指标。本研究显示，异甘草素作用于24 hpf斑马鱼胚胎，整体上有减慢心率的作用。有文献报道(Noguchietal.，2008；Zhangetal.，2009，2013)，异甘草素可激活心肌保护信号通路，保护心脏免受缺血再灌注损伤和抗心律失常的作用，并可通过AMPK信号通路改善缺氧心肌细胞收缩功能障碍。其次，异甘草素可通过增加L型Ca2+电流对心脏产生正性肌力效应并对K+电流有一定的抑制作用。本研究结果提示，异甘草素可显著降低斑马鱼胚胎心率，随着作用时间延长，中低剂量组(2～8 μg·mL-1)斑马鱼胚胎心率又呈现先降低再略有升高的趋势，推测异甘草素在该浓度范围内对斑马鱼胚胎心脏有一定的保护作用，其保护作用可能与上述作用有关。而在剂量较高时(≥10 μg·mL-1)，对心率具有持续的抑制和诱发心脏畸形的作用，提示高剂量异甘草素会产生毒副作用。

综上所述，中低剂量异甘草素对斑马鱼胚胎具有良好的抗血管生成和减慢心率的作用，而高剂量有一定毒性。但客观来看，药物均有一定偏性，关键在于如何将药效最大化而毒性最小化，只要科学合理使用，定能发挥药物的长处，服务于人民大众。