13种中药体外抑制猪传染性胸膜肺炎放线杆菌试验

蔡丙严， 田其真， 戴建华， 刘 莉， 郝福星， 李 雅

(江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300)

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌极易感染2～4月龄的猪，临床上称为猪传染性胸膜肺炎，其临床症状主要表现为出血性纤维素性胸膜肺炎，可造成猪的突然死亡，给规模化猪场造成严重的经济损失[1]。该病现已在世界上许多国家和地区普遍存在[2]，近年来我国中小规模的养猪场，尤其是商品猪育肥的中后期多发[3]，同时，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌对现有抗生素极易产生耐药性[4]，而现有疫苗多为针对某种血清型的单价或多价苗，不能满足对所有血清型的免疫[5]。伴随市场对绿色无公害猪肉产品的需求，寻求开发具有显著治疗效果的药物具有重要的临床意义。我国中药资源丰富，中医药文化博大精深，而中兽药制剂对猪病的防控已成为当今兽医临床上研究的热点[6]。现代中药药理研究结果表明，部分清热解毒功效的中药具有抑制多种病原微生物的作用[7]。为了筛选临床上具有显著抑制猪传染性胸膜肺炎放线杆菌活性的中药并进行组方，笔者所在项目组收集了13种具有清热解毒功效的中药，采用水提法制备中药药液，对临床上分离得到的有致病性的猪传染性胸膜肺炎杆菌进行体外药敏试验，筛选出有显著抑菌活性的五倍子、野拔子、大黄连等3种单味中药和五倍子与野拔子的1个中药复方，以期为后期研制抑制猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的复方中药制剂、探索中药防治猪传染性胸膜肺炎奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以江苏省某猪场提供的病猪肺脏作为病样，经江苏农牧科技职业学院猪病检测中心分离鉴定为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌致病菌株，-70 ℃冰箱保存备用。

翻白草、野拔子、虎杖、透骨草、癞蛤蟆草、小黄连等13种中药，采自海拔约1 700 m处的云南禄劝彝族苗族自治县，为当地野生药材，经当地药检部门鉴定为地道中药材。

胰蛋白胨大豆琼脂(tryptic soy agar，简称TSA)培养基、胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth，简称TSB)培养基，均购自碧迪医疗器械(上海)有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，简称NAD)，购自Roche公司；无支原体犊牛血清购于江苏晶美生物科技有限公司。

电子天平(Sartorius)、气浴恒温振荡培养箱(JY92-IID)、超净工作台(AH-100)、CO2培养箱(HF151)均购自南京瑶恩仪器设备仪器有限公司；电子万用炉，购自西安广大电炉有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 中药水煎液制备 分别称取25 g五倍子、小黄连、大黄连、野拔子、金银花、马鞭梢、透骨草、苎麻、虎杖、翻白草、清于胆草、冬凌草、癞蛤蟆草等13种中药，置于100 mL蒸馏水中浸泡1 h，在万用炉上用大火加热至煮沸，改为文火煮 30 min，文火时要保持微沸状态，收集第1次的煎液，继续加100 mL水，同法煎制，30 min后收集，将2份煎液混匀，滤纸过滤，加热浓缩至浓度为1 g/mL，用2%～4% NaOH溶液调节药液的pH值为7.2～7.4，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，4 ℃ 保存备用。

1.2.2 TSA培养基平板与TSB菌液制备 参照文献[8]，制备TSA培养基平板及TSB液体培养基，均加入0.02% NAD和5%犊牛血清，置于4 ℃冰箱备用。取0.1 mL已分离鉴定保存的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，接种于TSB液体培养基，在37 ℃气浴恒温振荡培养箱中150 r/min培养8 h，最后将细菌浓度稀释至106～107CFU/mL，即用。

1.2.3 单味药及部分复方中药药敏试验 用新华定性滤纸打孔制成直径为6 mm的药敏纸片，分装于药敏瓶，每瓶50片，121 ℃ 高压灭菌15 min，烘干后加入1 mL制备好的单味药液，中药浓度为20 μg/片，浸泡2 h后烘箱烘干，放入 -20 ℃ 冰箱保存备用。将培养好的菌液取0.1 mL用涂布棒均匀涂布在TSA固体培养基上，待其干燥，将药敏纸片贴在平皿上，放入CO2培养箱中，37 ℃恒温培养36～48 h，观察结果，测量含药纸片抑菌圈直径。根据抑菌圈直径大小，选取敏感度较高的单味药液制成复方，各取0.5 mL混匀加入纸片瓶中，其他步骤同单味药，观察结果。

1.2.4 最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，简称MIC)测定 选择对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌有中度敏感以上的单味中药及复方，采用二倍稀释法[9]测定MIC。在无菌条件下，取10支高压灭菌过的试管，1～9支为试验组，第10支为对照组。分组编号后向1～10管中各加1 mL TSB液体培养基，吸取1 mL药液加入第1管，混匀后吸取1 mL加入第2管，依次至第9管，混匀后弃去1 mL，此时试管内药液质量浓度分别为500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90、1.95 mg/mL，第10管不加药物。用微量移液器取0.1 mL菌液加入1～10管中，充分摇匀，37 ℃恒温振荡培养18～24 h后，分别观察细菌的生长状况并作好记录。若试验管中溶液浑浊，则表示细菌生长状况良好，该浓度药液没有抑菌作用；如果试验管中没有浑浊，则说明猪胸膜肺炎放线杆菌的生长受到了抑制，此时的药液稀释浓度即为该药物的最小抑菌浓度。

1.2.5 最小杀菌浓度(minimum bactoricidal concentration，简称MBC) 依据MIC测定的结果，继续培养试验管至48 h，在试验组中取出没有生长细菌的试管，用微量移液器吸取 0.1 mL 用涂布棒涂布于TSA培养基平板上，于37 ℃培养 24～36 h，观察结果，以细菌菌落个数不超过5个的管内药物浓度为该药的最小杀菌浓度。

2 结果与分析

2.1 单味药及部分复方中药药敏试验结果

13种单味中药及2种复方中药体外抑制猪传染性胸膜肺炎的药敏试验结果见表1。

由表1可知，五倍子、野拔子、大黄连等3种单味中药对猪胸膜肺炎放线杆菌有明显的抑制作用，尤其是对五倍子表现为高度敏感。对金银花、透骨草、清鱼胆草、翻白草、苎麻根、虎杖、冬凌草、癞蛤蟆草等表现为低度敏感，对小黄连、马鞭梢则不敏感。五倍子与野拔子、五倍子与大黄连2种复方中药对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抑制作用优于单味五倍子、大黄连，中药复方后2种药物有协同作用，药效有所增强。

表1 单味药及部分复方中药药敏试验结果

注：猪胸膜肺炎放线杆菌药敏试验的抑菌圈直径标准：>20 mm为极度敏感；15～20 mm为高度敏感；10～14 mm为中度敏感；<10 mm 为低度敏感；无抑菌圈的为不敏感[10]。

2.2 最小抑菌浓度与最小杀菌浓度测定结果

由表2可知，五倍子与野拔子中药复方的MIC与MBC分别为3.90、7.80 mg/mL，对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌有明显的体外抑制作用，属高度敏感药物。五倍子单味中药、五倍子与大黄连中药复方两者之间的MIC与MBC结果相同，分别为7.80、15.60 mg/mL，同属高度敏感药物。单味中药野拔子、大黄连两者之间的MIC与MBC相同，分别为31.25、62.50 mg/mL，属于中度敏感药物。上述药物MIC与MBC测定结果与抑菌圈直径测量结果基本一致。

3 讨论与结论

本研究所选五倍子、野拔子、大黄连等均为清热解毒类中药，具有较显著的体外抗菌活性。其中，五倍子有清肺、解毒的功效，可治肺虚咳嗽、下痢、腹泄，对变形杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、肺炎球菌均有抑制作用[12]。野拔子是云南地区的一种药食同源植物，具有疏风解表、利湿、消食化积的功效，研究表明其粗提液对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌有较好的抑制效果[13]。大黄连为毛茛科植物黄连、三角叶黄连或云连的干燥根茎，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，现代药理研究表明，其对多种细菌、真菌以及病毒均有较好的拮抗作用[14]。本研究结果显示，五倍子、野拔子、大黄连等3种单味中药对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌具有明显的体外抑菌活性，尤其是五倍子，为高度敏感药物，抑菌圈直径为15 mm。以五倍子为主药分别配伍野拔子、大黄连组成的复方中药，其对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的抑菌活性比单味中药有所增强，两者配伍有协同抑菌作用。

表2 单味中药及复方MIC与MBC测定结果

注：“-”表示细菌未生长；“+”表示细菌生长。判定标准：MIC≤7.80 mg/mL为高度敏感；7.80 mg/mL

本研究所选的13种中药对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的体外抑制作用，与康帅报道的20种中药对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的抑菌活性中，黄连、虎杖等为中度敏感药物的结论[15]较为一致。刘仁志等报道，大蒜挥发油及其复方对猪胸膜肺炎放线杆菌的最低抑菌浓度为3.90 mg/mL，最低杀菌浓度为7.80 mg/mL[16]，本次试验中五倍子与野拔子复方的MIC、MBC与之相一致。中药体外抑菌活性试验结果受众多因素如试验手段、条件、中药批次、提取方式不同等的影响，因此在进行相关试验时要采取科学的试验方法、统一的测定标准，以提高结果的准确性。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染已成为养猪业的一大威胁，在一定程度上阻碍了育肥猪的健康养殖。目前临床上主要治疗方法是注射头孢噻呋、氟苯尼考等广谱抗生素，由于不按疗程、盲目加大剂量等不规范用药，使该菌产生了一定的耐药性，治疗效果已不明显，且过多抗生素在猪体内蓄积，亦严重危害人类健康。众多研究结果表明，中药在防治猪胸膜肺炎放线杆菌上具有较好的疗效，并且已经取得一定的成果。本研究所筛选的中药五倍子与野拔子复方，体外具有显著的抑杀猪传染性胸膜肺炎放线杆菌活性，为后续临床疗效奠定了基础。研发以五倍子与野拔子为主药的中药制剂，对临床防治猪传染性胸膜肺炎放线杆菌具有广阔的应用前景。