大叶蒲公英耐盐突变体的筛选与植株再生

刘艳芬， 王秀萍， 陈翠果， 梁伟玲， 王婷婷

(1.河北工程大学园林与生态学院，河北邯郸 056021； 2.唐山市植物耐盐研究重点实验室/河北省农林科学院滨海农业研究所，河北唐山 063200)

盐害是影响作物产量的一种主要的非生物逆境危害，土壤的盐渍化已成为限制我国农业发展的主要因素。如何开发利用盐碱地，以增加有效可耕地面积、提高作物产量，已成为当前农业学科研究的重要任务之一。目前，培育耐盐作物品种、提高作物耐盐性，已成为开发利用盐碱地、提高经济产量最根本和最有效的方法[1]。已有研究表明，在盐渍化土壤和海水或咸水胁迫下生长的植物，能够更多地积累营养元素和活性物质，具有更好的营养、药用和其他经济品质，这使得通过各种途径筛选培育多样化的耐盐经济植物更具有必要性[2]。

通过组织培养获得愈伤组织的耐盐突变体，进而培育出耐盐的品种或品系，是蒲公英生物技术抗性育种的研究方向之一。蒲公英(Taraxacummongolicum)是对菊科蒲公英属植物的通称，种类繁多。一些生长在盐渍环境中的蒲公英种类生物量小，难以在盐碱地区获得高产[2]。大叶蒲公英是野生蒲公英的四倍体变异体，其营养价值、医疗价值和经济价值都较高，而且生物量大，是有待推广的新品种，但其耐盐性却较弱。本研究以大叶蒲公英叶片为外植体，通过盐胁迫处理，从愈伤组织中诱导产生耐盐突变体，进而诱导突变的愈伤组织再生成完整植株，旨在为蒲公英的耐盐育种和快速高效的离体再生体系提供依据，也为更好地开发和利用蒲公英奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为大叶蒲公英叶片。将大叶蒲公英种子盆栽播种，剪取生长20～30 d的幼叶作外植体诱导愈伤组织，筛选耐盐突变体后，诱导形成不定芽与不定根，获得再生植株。

1.2 方法

1.2.1 大叶蒲公英愈伤组织耐盐突变体的获得

1.2.1.1 愈伤组织诱导培养基的筛选 将大叶蒲公英叶片剪成1 cm2左右的小块，常规消毒后，将外植体分别接种到不同诱导培养基上，接种45 d后统计各处理愈伤组织的发生率和生长状况。诱导培养基设5个处理：处理1，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；处理2，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；处理3，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.02 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA；处理4，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.04 mg/L 2，4-D；处理5，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.06 mg/L 2，4-D。

1.2.1.2 耐盐愈伤组织突变体的筛选与鉴定 将继代5次的愈伤组织切成0.5 cm×0.5 cm左右的小块，分别接种于附加NaCl含量为0%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%的继代培养基上，进行盐胁迫处理，从中选出愈伤组织耐盐突变体，转入无盐和耐盐培养基上交替培养2次，再将其转到无盐继代培养基上扩增培养2个月。将筛选出的突变愈伤组织与对照进行随机扩增多态性DNA(RAPD)检测。

1.2.2 蒲公英耐盐突变体的植株再生

1.2.2.1 耐盐突变体不定芽的诱导 将多次继代的耐盐愈伤组织突变体转接到不同的不定芽诱导培养基上，根据不定芽发生状况，筛选出适合的不定芽诱导培养基。处理1：MS+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；处理2：MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；处理3：MS+0.3 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；处理4：MS+0.1 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA；处理5：MS+0.2 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA；处理6：MS+0.3 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA。

1.2.2.2 耐盐突变体不定根的诱导 将耐盐突变体的不定芽丛经过多次继代，获得较多数量的不定芽，此时不定芽嫩弱，不利于生根。转入不含生长调节剂的壮苗培养基继代 1～2次。之后将不定芽剪切成最小芽丛，转接到含有不同生长素的生根培养基中进行生根诱导。诱导20 d后，根据不定根的发生状况，选出适合的生根培养基配方。对照：1/2MS(不含生长条件物质)；处理1：1/2MS+0.1 mg/L IBA；处理2：1/2MS+0.3 mg/L IBA；处理3：1/2MS+0.1 mg/L NAA；处理4：1/2MS+0.3 mg/L NAA。在整个组织培养过程中，如无特殊情况说明，培养条件如下：温度(23±2) ℃，每天光照16 h，光照度 2 500 lx。培养基中含琼脂5.5 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8。

2 结果与分析

2.1 大叶蒲公英愈伤组织耐盐突变体的获得

2.1.1 愈伤组织诱导培养基的确定 在不含2，4-D的培养基中，愈伤组织发生率较低，面积小，质地紧凑。随着 2，4-D 浓度的增加，愈伤组织的发生率逐渐提高，且愈伤组织面积逐渐变大。但是在处理5中的愈伤组织质地变得疏松，不利于继代培养，这可能与2，4-D浓度过高有关(表1)。因此，选择处理4，即MS+0.5 mg/L 6-BA+0.04 mg/L 2，4-D 作为愈伤组织诱导的合适培养基(图1)。从愈伤组织分布来看，叶片切块的部位不同，愈伤组织的发生量有所不同，含叶脉的比不含叶脉的切块产生的愈伤组织面积大，形成速度快。因此，尽量切取叶脉附近的叶片作为外植体，以获得更多的愈伤组织。

表1 大叶蒲公英叶片外植体在不同诱导培养基上愈伤组织发生情况

2.1.2 愈伤组织耐盐突变体的获得 将初代培养的蒲公英愈伤组织在原诱导培养基上继代多次后，愈伤组织变得松散，于是将其继代于降低了2，4-D浓度的培养基上，根据愈伤组织生长状况和增殖率，确定了培养基配方为MS+0.4 mg/L 6-BA+0.02 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA。在此继代培养基上，愈伤组织的生长速度快，质地结构适中。

愈伤组织接种在上述继代培养基上，分别附加NaCl含量为0%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%、2.0%进行盐胁迫培养。1周后愈伤组织开始变褐，2周至3周后逐渐死亡，4周后绝大部分愈伤组织变褐死亡，但在个别的愈伤组织内部，发现有黄绿色的愈伤组织存活(图2)。NaCl含量为 2.0% 的愈伤组织全部死亡。将存活愈伤组织接种到含有相应NaCl浓度的培养基上继续耐盐培养，每3周继代1次，耐盐继代4次后，转入含0%和2%NaCl培养基上交替培养2次。之后在无盐培养基上增殖，获得了更多的耐盐愈伤组织。

将对照与NaCl含量分别为0%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%(代号分别为CK、y0、y1、y2、y3、y4、y5、y6)的耐盐愈伤组织进行RAPD检测，确定突变体。共采用15条随机引物对耐盐突变体和对照进行RAPD分析，随机引物分别是S36、S224、S262、S267、S308、S358、OPA-19、OPC-05、OPD-05、OPG-06、SJ14、OPC-11、OPB-12、S90、S309。由图3可以看出，S358引物对6号(1.2% NaCl)、OPA-19引物对5号(1.0% NaCl)、OPC-05引物对4号(0.8% NaCl)愈伤组织均扩增出了与对照不同的差异条带。因此可见，NaCl含量为0.8%、1.0%、1.2%的培养基上存活下来的愈伤组织遗传物质均发生了变异，本次盐胁迫获得的蒲公英耐盐愈伤组织为耐盐突变体。

2.2 蒲公英耐盐突变体的植株再生

2.2.1 耐盐愈伤组织不定芽的诱导 研究发现，不同种类和浓度的生长调节物质组合对于愈伤组织不定芽的发生有重要影响(表2)。愈伤组织在较高浓度6-BA(处理3、处理6)的培养基上，不定芽发生数量较多，但叶片较细小，甚至有玻璃化发生。在较低浓度6-BA(处理1、处理4)培养基上，不定芽发生数量较少。处理3、处理6、处理2的不定芽增殖率与其他处理有显著差异，三者之间差异不显著，但处理2，即培养基配方为MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA的不定芽生长健壮，有利于不定芽的继续增殖和生根培养，选择此培养基作为耐盐愈伤组织生成不定芽的最适培养基(图4)。

表2 不同生长调节物组合的培养基上不定芽生长状况

注：同列数据后标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。增殖率=继代后的不定芽总数/原不定芽数。

2.2.2 耐盐愈伤组织不定根的诱导 研究发现，可将增殖的不定芽在生根之前先转入无激素的MS培养基上壮苗(图5)。生根诱导20 d后，在不含生长素的对照培养基中，也有不定根发生，但是生根率低，根系生长慢(表3)。随着NAA浓度的提高，生根率明显提高，但是NAA浓度为0.3 mg/L与 0.5 mg/L 的生根率较为接近，虽然前者不定根均长略短，但平均根数较多，利于移栽成活。单独添加IBA的生根效果没有单独添加NAA的效果好。因此，选择处理3，即配方为 1/2MS+0.3 mg/L NAA作为蒲公英耐盐愈伤组织的最适生根培养基(图6、图7)。

表3 不同生长调节物质组合培养基上的不定芽生根状况

3 结论与讨论

3.1 结论

为获得大叶蒲公英耐盐突变体再生植株，本试验以其叶片为外植体，将诱导出的愈伤组织经过不同浓度耐盐胁迫处理，经过筛选与RAPD检测，确定获得了相应盐浓度(NaCl含量分别为0.8%、1.0%、1.2%)的耐盐愈伤组织突变体。再通过分别诱导突变愈伤组织形成不定芽和不定根，获得耐盐突变体的再生植株。结果发现，大叶蒲公英愈伤组织最适诱导培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.04 mg/L 2，4-D，耐盐突变体不定芽发生的最适培养基为MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，最适生根培养基为1/2MS+0.3 mg/L NAA。

3.2 讨论

获得耐盐愈伤组织的方法一般有2种，一是将外植体直接接种到含盐培养基上诱导耐盐愈伤组织[3]；二是将普通的愈伤组织转移到盐浓度恒定[4-5]或逐次递增[6-8]的培养基上，通过多次继代，选出稳定生长的愈伤组织。将愈伤组织直接置于含有高于选择浓度NaCl的诱导培养基上，虽然可减少形成生理适应细胞，但有可能淘汰某些本来可能存在的变异。张新果等将蒲公英愈伤组织直接继代到含有1.5%NaCl的培养基上，获得了12株耐1.5% NaCl的蒲公英再生植株，但对其有性后代的耐盐性未作进一步研究[5]。本试验将蒲公英叶片愈伤组织接种在盐浓度递增的诱导培养基上，筛选出了耐盐的愈伤组织突变体。虽然这种方法容易产生生理适应的细胞或组织，但是本试验结果表明，可以获得不同浓度级别的蒲公英耐盐愈伤组织变异系。

利用组织和细胞培养筛选耐盐性突变体植株，虽然在我国已取得了较大进展，但仍存在一些问题需要解决[9-10]。如部分植物的愈伤组织或细胞系的耐盐性和再生植株的耐盐性表现并非完全一致、耐盐系难以分化成再生植株、耐盐突变体植株农艺性状的改变等。目前，笔者将不同耐盐级别的愈伤组织突变体再生出完整植株移栽入大田，并已开花结实。下一步将进行田间的耐盐性鉴定，直接鉴定耐盐变异体的耐盐程度和变异稳定性。