中性蛋白酶酶解海洋鱼鳞蛋白的工艺条件

万婧惊 王青华 唐旭 黄仕新 徐长安

摘要：如何充分利用水产加工废弃物资源越来越受到重视。文章利用中性蛋白酶酶解海洋鱼鳞蛋白制备鱼鳞蛋白多肽。通过考察温度、时间、酶量、料液比等单一因素对水解鱼鳞蛋白的影响，确定并设计了L9（34）正交实验因素和水平，最终获得了中性蛋白酶酶解鱼鳞蛋白优化工艺条件，即酶量4%（质量分数），温度45℃，时间3h，料液比10%。在此条件下，酶解所得水解度为28.9%。与文献比较，该工艺条件下水解时间大大缩短。该条件所得蛋白肽段的分子量主要分布在l-6KDa范围内。由此可见，该优化条件适合规模化生产，所得蛋白肽可以满足食品、化妆品行业的需求。

关键词：中性蛋白酶;海洋鱼鳞;蛋白水解;条件优化

鱼鳞是鱼真皮层的变形物，占鱼体总重的3%～5%，含有丰富的蛋白质和矿物质，鱼鳞总重的41%—55%的有机物中，90%以上为胶原蛋白和鱼鳞硬蛋白。

中医自古以来就有使用鱼鳞胨治疗妇科疾病的历史。随着现代科学以及现代营养学的发展，鱼鳞作为营养和食疗皆优的佳品，越来越受到关注。鱼鳞中含有的丰富胶原蛋白被低温提取作为生物医用材料原料，具有促进神经再生、创口愈合等功能。其水解产物中也含有大量的活性肽成分，具有促进皮肤新陈代谢、延缓皮肤衰老、预防治疗骨关节疾病、降血压、抗血脂等功效，市场应用前景十分广阔。

中国是人口与资源大国，渔业和水产加工发达，但加工废弃物并没有得到充分利用，每年仅淡水鱼鳞废弃量就达到了30万吨/年。对其进行合理加工利用，既节约资源、保护环境，又可进一步延伸拓展低值水产加工资源向高值产品转化的循环经济技术链。

胶原肽的制备方法主要包括化学水解法和生物酶水解法等。前者是利用酸或碱水解胶原蛋白，虽然方法简单、成本低廉，但水解过程中能破坏氨基酸，营养损失大，产物复杂，且产生的废水多，生产周期长;后者具有水解效率高、条件温和、易于控制水解进程等优点。广泛使用常用的蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。中性蛋白酶也被用来水解水产品，张其标等人使用中性蛋白酶水解鲢鱼肉糜获得较优的水解条件，与酸性蛋白酶相比可以获得更多的氨基酸;肖安风等人应用中性蛋白酶水解巴浪鱼，水解10个小时获得较高水解度。但使用中性蛋白酶水解鱼鳞蛋白报道较少，而且耗时较长。李春美等人将中性蛋白酶应用于鱼鳞的酶解反应中，经7小时后发现鱼鳞消失，水解完成。为适合规模化生产需要，文章采用4因素3水平（L9（34））正交实验，利用中性蛋白酶酶解海洋鱼鳞.优化酶解工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

美国红鱼鱼鳞（Sciaenops ocellatus）：购白福建东山，经洗涤、脱脂和脱钙处理后干燥备用;中性蛋白酶：南宁庞博生物工程有限公司，酶活力20万U·g-l;化学试剂：购自西陇化工有限公司，其中碳酸氫钠为食品级，其他均为分析纯。凝胶色谱蛋白对照品，购自Sigma，名称（分子量），Superd-ex 200：Thyroglobulin （669KDa），Ferritin （440KDa），BSA （67KDa），β-Lactoglobulin （35KDa），Cytochrome（13.6KDa），Aprotinin （6512）;Superdex peptide：Cytochrome C（12.5KDa），Aprotinin （6512），Vitamin B12（1355），Gly-Gly-Gly （189），Glycine （75）。

1.2 仪器

电子天平：METTLER TOIJFDO AL104型;烘箱：上海恒一科学仪器公司，DHG-9240A型;酶标仪：美国分子仪器公司，SpectraMax M5型;pH计：Sartorius PB-10型。凝胶色谱柱：美国GE公司，Superdex 200 10/300 GL，柱体积23.56 mL;Su-perdex peptide 10/300 GL，柱体积23.56 mL。

1.3 实验方法

1.3.1 实验工艺流程

脱脂、脱钙干鱼鳞一稀碳酸氢钠溶液浸泡一蒸馏水清洗并调至中性一加热预处理lOmin一调pH一酶水解一灭酶一测定水解度

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 总蛋白含量：微量凯氏定氮法。

1.3.2.2 水解液游离氨基酸总量：茚三酮显色法。

1.3.2.3 水解度的计算

DH=xl00%

1.3.3 单因素对酶解效果的影响

分别称取备用的鱼鳞4份，预处理后调整体积以及pH至6.0，加入实验设计用量的中性蛋白酶，在实验温度下进行酶解反应，观察并记录鱼鳞完全水解所需时间或测定水解度，用以考察酶用量、温度、料液比和时间对酶解效果的影响。

2 结果与讨论

2.1 酶用量对鱼鳞水解速度的影响

取4份5.0 g处理备用的干鱼鳞，按料液比为1：10经预处理后，分别加入0.05，0.1，0.2，0.3g中性蛋白酶，根据作者前期工作结果以及文献报道，调pH至6.0左右，于50℃酶解，观察并记录鱼鳞完全水解所需时间，考察酶量对水解效果的影响，结果见图l。

由图l可看出.酶解时间随着酶量的增加而呈降低趋势，而酶量从0.2g增加到0.3g时，水解时间对酶量曲线的斜率变小，二者水解时间几乎没有相差，表明如果酶量再增加的话，其对酶解的影响将逐渐减小，可能是由于酶量的增加，蛋白中的肽键大量断裂，也产生不少氨基酸或副产物，对酶活性部位不同程度地产生抑制作用，使得蛋白酶的酶促作用有所下降。同时，随着酶用量的增加，0.2g到0.3g，酶解时间缩短的幅度减小情况下，成本增加了50%。因此，从经济成本角度考虑，确定酶用量0.2g，即4%（质量分数，下同）。

2.2 温度对鱼鳞水解速度的影响

取4份5.0g处理备用的干鱼鳞，按料液比为1：10经预处理后，分别加入0.2 g中性蛋白酶，调pH 6.0，分别于30，40，50，60℃进行酶解，观察并记录鱼鳞完全水解所需时间，考察温度对酶解效果的影响，结果见图2。

在图2中，在实验的设定范围内随着反应温度的增加，从30℃升至40℃时，酶解完成时间基本不变，为4h左右。当温度为50℃时，水解时间迅速变短至最低，之后温度上升，酶解完成时间反而变长。反应温度较低时，反应体系粘度大，底物分子与酶分子相互接触较为困难。故反应速度较慢：随着反应温度的上升，溶液的粘度下降，分子运动的速度加快，底物分子中的反應键或基团与酶的活性部位相接触的机会大大增加，酶活增强，反应速度增大，至50℃时，酶活性最佳。此后，当温度再升高至60℃时，由于升高温度引起的酶热失活增加，从而降低了酶的有效浓度，反应速度又呈下降趋势。故选取50℃为酶水解温度最适水平参考点。

2.3 料液比对酶解的影响

分别取1.0， 5.0，10.0，15.0g鱼鳞，加入50mL水经预处理后，加入0.2g中性蛋白酶，调pH6.0，于50℃进行酶解，观察并记录鱼鳞完全水解所需时间，考察料液比对酶解效果的影响，结果见图3。

在恒温水解反应过程中，动力学参数a值是一个跟初始蛋白酶浓度与初始底物浓度的比值.由图3可以看出，固定初始中性蛋白酶的浓度，酶解效率随着料液比的增加而降低，符合该动力学模型。在实验设计的4个条件中，料液比为20%（质量分数，下同）和30%时反应速度都比较慢，所用时间都比较长，。当浓度较高时，反应体系粘度大，底物分子与酶分子相互接触较为困难，故反应速度较慢;随着料液比的降低，溶液的粘度下降，分子运动所受的阻力减小，速度加快，底物分子中反应键或基团与酶活性部位相接触的机会大大增加，反应速度增大。虽然料液比为5%与10%时的速度比较快而且相当，但是溶液过稀也会大大增加生产成本。因此，综合考虑10%为参考点。

2.4 酶解时间对水解度的影响

取4份5.0g处理备用的干鱼鳞，按料液比为1：10经预处理后，加入0.2g中性蛋白酶，调pH6.0，于50℃进行酶解.酶解时间分别为2，2.5，3，3.5小时，测定鱼鳞蛋白的水解度以考察酶解时间的影响，结果见图4。

图4结果显示，酶解时间对水解度的影响较小。当水解时间增加，水解度随之上升，但幅度不大。当酶解时间为3-3.5h时，水解度不再随反应时间而变化，基本保持不变。推测可能是由于反应时间的增长，水解产物中的某些氨基酸残基逐步占据了中性蛋白酶的活性部位，产生了竞争抑制作用，致使水解反应无法再继续进行，故确定3h为最适水解时间水平参考点。

2.5 正交实验

根据以上单因素实验结果，以温度、酶用量、料液比、酶解时间为因素设计4因素3水平正交试验L9（34），进一步优化酶解工艺条件。

根据表2结果，极差大小的顺序为料液比>酶用量>时间>温度。极差愈大，对结果的影响也越大，因此料液比对酶解的影响远远大于其他三者。由此结果可以得出中性蛋白酶酶解鱼鳞的最佳水解条件为A1B2C1D2，即酶用量4%，温度45℃，料液比10%，时间为3h。该条件与文献报道的结果相比，大大减少了酶解时间，可能是由于适当提高了酶用量以及适当降低了料液比，使得蛋白酶可以与底物更加充分接触，增加了碰撞的机会，从而加速反应，大大缩短了时间，提高了酶解效率，同时也降低了酶解温度，较好的控制了苦味肽的释放。

用上述优化的工艺条件进行确认试验，做三份平行，最终水解度平均值为28.9%。

2.6 鱼鳞蛋白肽分子量分布

将2.5中条件下水解获得的鱼鳞蛋白肽酶解液稀释5倍，自动进样，Superdex凝胶柱分离，与标准蛋白对照品比对，检测分析在该条件下水解所得蛋白肽的分子量分布，结果见图5和图6。实线为样品峰.虚线为蛋白对照品的峰。

凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试，目前已被广泛用于生物化学、分子生物学、分子免疫学以及医学等有关领域。鱼鳞蛋白基本上是由胶原蛋白和硬蛋白组成，这两种蛋白均是结构蛋白，分子量都大于300 KDa。

实验中使用Superdex 200和Superdex pep-tide两种凝胶柱进行分离分析。前者填料的颗粒较粗，适用于分子量较大的蛋白分离，由图5可知，鱼鳞蛋白经过碱性蛋白酶水解后，大分子量区域呈平直的基线水平，说明原料几乎全部被分解成10 KDa以下的片段。后者填料颗粒相对较小，从图6结果可以看出，鱼鳞蛋白水解后肽段分子量分布主要集中在第2和第3个峰之间，即1-6Ku范围内。从谱图中多肽的分子量分布来看，中性蛋白酶能够将鱼鳞蛋白很好地水解，所得的蛋白肽段的大小比较合适，适合食品及化妆品行业的需求。如果水解度过高，芳香族等疏水基团将暴露出来，会造成苦味肽大量产生。

3 结论

文章采用中性蛋白酶酶解海洋鱼鳞蛋白，通过对酶解反应影响因素的单因素考察以及L9（34）正交实验设计，获得了优化条件，即温度45℃、酶用量4%、料液比10%和时间3h。比文献报道大大缩短了酶解时间，降低了酶解温度，提高了酶解效率。通过酶解产物分子量分布分析，在上述优化的条件下，中性蛋白酶可以很好地将鱼鳞蛋白水解成1-6KDa大小的肽段.适合食品和化妆品行业的需求。

以资源丰富的海洋鱼鳞蛋白制备一系列多肽产品具有广阔的应用领域，横跨化工业、食品行业、化妆品业、医药业等。因此，该系列产品的开发有着美好的前景，可以真正地实现低值资源的“变废为宝”高值化利用。

参考文献（略）