结直肠癌中MACC1的表达及与淋巴结转移的相关性

邱丽浈 吴共发 刘钰君 黄绮亭 曾宇婷 李海刚，3

广州市增城区人民医院1体检中心，2病理科（广州 511300）；3中山大学孙逸仙纪念医院病理科（广州510120）

结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是消化系统常见的恶性肿瘤，截止2014年CRC的发病率居我国恶性肿瘤的第3位，病死率位居全国恶性肿瘤的第4位［1-2］。目前，对CRC的治疗以外科手术为主，采用放化疗以及靶向治疗等综合治疗方法，然而CRC根治术的5年生存率仅约50%，侵袭和转移仍然是导致患者死亡的主要原因［3］，所以，阐明CRC侵袭和转移的具体机制，寻找特异有效的治疗靶点，具有重要意义，但CRC的侵袭和转移是牵涉到多步骤、多阶段和多基因的复杂生物学过程，至今所涉及的分子机制尚未阐明。结肠癌转移相关基因-1（metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1）是2009年被证实的一个与结肠癌转移密切相关的基因［4］，有望为CRC分子靶向治疗提供新的策略［5］。目前国内外针对MACC1在CRC中的相关研究均有报道，但MACC1在CRC发生、发展以及作为治疗靶点的相关机制尚未完全阐明。本研究在组织学和细胞学水平层面，以有无淋巴结转移为切入点，采用免疫组化和免疫细胞化学方法检测CRC组织和不同转移潜能的CRC细胞系中的MACC1表达，探讨CRC中MACC1表达与淋巴结转移的关系，为后续进一步研究MACC1在CRC侵袭和转移中的作用以及是否能作为治疗靶点提供初步理论基础。

1 资料与方法

1.1一般资料选取广州市增城区人民医院病理科库存的2015年3月至2017年12月手术切除的77例大肠癌及癌旁石蜡组织，均经过4%中性缓冲甲醛固定及石蜡包埋。所有病例均有完整的临床资料并且经过病理诊断证实。结直肠癌的病理诊断根据WHO消化系统肿瘤分类标准第四版，临床分期参照美国癌症联合会（AJCC）第七版分期。所有病例术前未经放化疗。人结直肠癌细胞系SW480和SW620由南方医科大学基础医学院病理学系提供。兔多克隆浓缩型抗体MACC1（产品编号ab106579）购自英国abcam公司。即用快捷型免疫组织化学 MaxVisionTMHRP（Mouse/Rabbit）检测试剂盒（产品编号KIT-5002）、PBS缓冲液、DAB显色剂、柠檬酸盐抗原修复液和抗体稀释液均购自福州迈新公司。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学检测所有石蜡组织块4 μm厚切片，防脱玻片捞片后于70℃烤箱烤片30 min，常规脱蜡至水后玻片放入高压锅内，加入足量柠檬酸盐修复液至完全浸没玻片，电磁炉加热沸腾高压修复3 min，自然冷却后PBS漂洗5次，每3 min一次，玻片浸泡在医用双氧水中10 min，PBS漂洗5次，每3 min一次；加入抗MACC1一抗（稀释度1∶1 500），37℃孵育1 h，PBS漂洗5次，每3 min一次，加入二抗，37℃孵育20 min，PBS漂洗5次，每3 min一次；DAB显色，显微镜下控色，自来水终止DAB显色，苏木素复染细胞核，70℃烤片30 min至完全烤干水分后中性树脂封固。以人肝组织为阳性对照，PBS取代一抗作阴性对照。

1.2.2免疫组织化学结果判定MACC1阳性显色主要定位于细胞浆，少数可同时定位于细胞核。阳性显色为细胞中的相应部位出现棕黄至棕褐色颗粒着色。染色结果判定参照文献［6］，由高年资病理医师在双盲情况下对切片染色结果进行判读：按染色强度计分，无色计0分，淡黄色、棕黄色和棕褐色依次1、2、3分；再将阳性细胞数所占百分比打分：阴性判为0分，阳性细胞数百分比在≤10%、11%～50%、51%～75%和＞75%分别计1分、2分、3分和4分，染色强度与阳性细胞百分比的乘积＞3分判为免疫组化结果阳性。

1.2.3免疫细胞化学染色SW480和SW620细胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，培养条件为37℃含5%CO2的细胞培养箱。取6个不同培养批次的生长状态良好的细胞，胰酶消化后低速离心收集，制作石蜡包埋细胞块，细胞块制作方法按照文献［7］。石蜡细胞块4 μm厚切片，免疫细胞化学检测检测操作方法同上述免疫组织化学检测。以棕黄色为阳性信号，按照染色深浅，分为弱阳性（1+），中等阳性（2+），强阳性（3+）。

1.3统计学方法采用SPSS 13.0统计软件，计量资料组间率的比较采用Pearson Chi-Square Test，结直肠癌淋巴结转移的多因素分析采用二分类的Logistic回归分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MACC1在CRC组织中的表达MACC1蛋白阳性表达于CRC组织的细胞浆，部分癌细胞的细胞核也有表达，癌组织周围的纤维间质也可见阳性表达（图1），MACC1蛋白在CRC组织的阳性表达率76.62%（59/77）。MACC1蛋白在癌旁正常黏膜组织中大部分呈阴性表达，阳性表达率11.69%（9/77）。统计显示MACC1在CRC组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常黏膜（χ2=65.83，P=0.00）。

图1 免疫组化检测MACC1在结直肠癌中的表达（MaxVisionTM×200）Fig.1 Immunohistochemical detection of MACC1 expression in colorectal carcinnoma

2.2MACC1与结直肠癌淋巴结转移的单因素分析经单因素分析可知，肿瘤分化程度、肿瘤大小、浸润深度、MACC1阳性表达、神经侵犯和临床分期可能是CRC淋巴结转移的高危因素（均P＜0.05），年龄、性别不是淋巴结转移的高危因素（均P＞0.05）。见表1。

2.3影响结直肠癌淋巴结转移的多因素Logistic回归分析对可能是影响结直肠癌淋巴结转移的6个高危因素进行Logistic回归分析，结果显示MACC1异常高表达、神经侵犯、浸润深度和临床分期是结直肠癌淋巴结转移的独立危险因素（均P＜ 0.05），见表2。

表1 结直肠癌与淋巴结转移的单因素分析Tab.1 The univriate analysis of lymph node metastasis in colorectal carcinoma例

表2 影响结直肠癌淋巴结转移的多因素Logistic回归分析Tab.2 The multivariate binary logistic regression analysis of lymph node metastasis in colorectal carcinoma

2.4不同转移潜能CRC细胞中MACC1表达情况MACC1蛋白在SW480细胞中呈弱或中等阳性表达（1+或2+），在SW620细胞呈中等阳性或强阳性表达（2+或3+）（图2）。统计分析显示，MACC1蛋白在SW620细胞中的表达明显强于SW480细胞（χ2=20.11，P=0.00，表3）。

图2 免疫细胞化学检测MACC1在SW480（A）和SW620（B）细胞中的表达（MaxVisionTM×200）Fig.2 Immunocytochemical detection of MACC1 expression in SW480（A）and SW620（B）cells

表3 MACC1在SW480和SW620细胞中的表达比较Tab.3 Comparision of MACC1 expression in SW480 and SW620 cells例

3 讨论

CRC的多学科综合治疗已迅速发展，但中晚期CRC的临床治疗效果有限，5年生存率仍然不高。国内外众多研究表明，侵袭和转移是至关重要的因素。因此，针对CRC侵袭和转移的策略成为研究的热点。MACC1蛋白定位于人类的7号常染色体上（7P21.1），具有广泛的生物学功能，特别是在调控恶性肿瘤的侵袭和转移等方面具有不可代替的重要功能［8］。已证实MACCl编码的蛋白质能通过调节激活肝细胞生长因子/肝细胞生长因子受体（HGF/c-Met）通路中的c-Met基因，上调c-Met蛋白的表达，促进肿瘤细胞发生侵袭和转移［9］。MACCl在多种恶性肿瘤如结肠癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、胃癌等组织中表达异常增高，与肿瘤临床分期、有无远处转移密切相关，有作为肿瘤转移和预后判断的潜在独立指标，有望为恶性肿瘤的基因治疗提供新靶点［10-11］。

本研究结果显示MACC1在CRC组织的阳性表达率显著高于癌旁正常黏膜，与文献报道的基本一致［11-12］。根据AJCC指南，发生区域淋巴结转移的CRC患者至少属于Ⅲ期［13］，所以淋巴结转移是CRC晚期患者的重要条件。为了更好评价MACC1在CRC侵袭转移中的作用，本研究以有无淋巴结转移为切入点，采用单因素分析可能与CRC淋巴结转移的高危因素。结果发现肿瘤分化程度、肿瘤大小、浸润深度、MACC1阳性表达、神经侵犯和临床分期等都可能是CRC淋巴结转移的高危因素。一般来说，肿瘤体积越大、瘤组织分化越差、出现淋巴结转移、神经侵犯和临床分期越晚，都与CRC不良预后密切相关，代表肿瘤细胞具有更强的侵袭力和转移特性［14］。本研究分析出来的与CRC淋巴结转移可能的高危因素基本上与文献报道符合［15］。

STEIN等［4］报道MACC1可以作为预测结肠癌转移的独立指标。本研究对可能是影响CRC淋巴结转移的6个高危因素进行Logistic回归分析，发现MACC1异常高表达、神经侵犯、浸润深度和临床分期是结直肠癌淋巴结转移的独立危险因素，在组织学水平证实了MACC1是CRC发生淋巴结转移的独立危险因素。在细胞水平，本研究发现MACC1在高淋巴结转移潜能的SW620细胞中高表达，在低淋巴结转移潜能的SW480细胞中低表达。SW620和SW480细胞系是从同一个大肠癌患者复发淋巴结病灶和原发病灶原代培养获得，两者具有一致的遗传学背景，因此为研究CRC淋巴结转移相关机制提供了一个合适的模型［16］。本研究这些结果综合提示MACC1蛋白高表达是CRC发生淋巴结转移的独立危险因素，与CRC的侵袭和转移行为密切相关。

综上所述，MACC1在CRC组织中表达明显增高，是CRC发生淋巴结转移的独立危险因素，提示MACC1在CRC中的表达增强，促使癌细胞具有更强的侵袭和转移能力，参与了结直肠癌的恶性进展，但本研究只是初步从组织及细胞水平探讨了MACC1与CRC淋巴结转移的关系，具体机制仍然有待后续研究深入探讨CRC中以MACC1为核心的上下游侵袭、转移调控机制，特别是与miRNA的靶向调节关系，以望为阐明CRC侵袭、转移机制及靶向基因治疗提供新的基础及策略。