番鸭细小病毒VP3基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

吴 萌， 朱善元， 吴海涛， 张继玲， 王安平

(江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300)

番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒(muscovy duck parvovirus，简称MDPV)引起的雏番鸭的一种急性、败血性传染病[1]，主要感染3周龄以内的雏番鸭，俗称三周病[2-3]。该病作为一种病毒病，重在预防，目前疫苗接种是最主要的预防方式。我国多在雏番鸭1日龄时进行MDPV弱毒苗免疫，但由于母源抗体的影响，以致弱毒苗不能对番鸭完全保护，国内外常有该病的报道[4]。因此，研究更为有效安全的MDPV疫苗是目前迫切的任务。

杆状病毒载体表达系统(baculovirus expression vector system，简称BEVS)是一个以昆虫杆状病毒为外源基因载体，以昆虫和昆虫细胞为受体的真核表达系统。该表达系统具有安全性高、对外源基因容量大、较好地转录后加工修饰等优点[5]。在杆状病毒表达系统这些优点的基础上，众多学者对该系统进一步进行研究改进，最为重要的是Bac-to-Bac系统的构建[6]，使杆状病毒表达系统能更好地适应基础研究和应用开发的需要。

本研究旨在Bac-to-Bac系统中成功表达番鸭细小病毒的VP3基因，为制备VLPs提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与血清 MDPV尿囊液、MDPV抗鼠多抗、PFastBac1载体、大肠杆菌DH5α、DH10Bac感受态细胞由笔者所在实验室提供。

1.1.2 酶类和主要试剂pfuDNA聚合酶、限制性内切酶NotⅠ、XhoⅠ及T4DNA连接酶购自加拿大Fermentas公司；质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；FITC标记的羊抗鼠二抗购自SouthernBiotech公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 参考GenBank中已发表的MDPVVP3的基因序列(登录号：AY510603.1)，设计1对用于扩增VP3基因的引物，引物由英潍捷基(上海)生物技术有限公司合成。引物序列为VP3-FB-F：5′-TATGGATCCATG GCAGAGGGAGGAAGC-3′；VP3-FB-R：5′-TAAGAGCT CCAGATTCTGAGTCAAATACC-3′。序列下划线处分别为上下游引物插入的NotⅠ和XhoⅠ酶切位点。

1.2.2VP3基因的扩增 将MDPV尿囊液煮沸5 min，-20 ℃ 冷冻10 min，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清为模板，VP3-FB-F、VP3-FB-R为上下游引物扩增VP3基因。反应体系：模板2 μL、dNTP(2.5 mmol/L)5 μL、10×PCR缓冲液5 μL、上下游引物(25 mmol/L)各2 μL、pfuDNA聚合酶(5 U/μL)1 μL，加双蒸水至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 转移载体pFastBac1-VP3的构建与鉴定 按胶回收试剂盒的说明书回收目的基因，经NotⅠ和BamHⅠ酶切后与经同样酶切的pFastBac1载体连接，转化DH5α感受态细胞，涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37 ℃培养过夜。挑取可疑单菌落培养，PCR初步鉴定，将鉴定正确的菌落提取质粒，并以NotⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定。酶切鉴定正确的菌株送至英潍捷基(上海)生物技术有限公司测序，测序正确的命名为转移载体pFastBac1-VP3。

1.2.4 重组Bacmid DNA的获得与鉴定 将PFastBac1-VP3重组转化DH10Bac感受态细胞，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL庆大霉素、10 μg/mL四环素、100 μg/mL X-gal及40 μg/mL异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的LB平板上，37 ℃培养48 h后出现蓝白斑现象。将疑似的白色单菌落接种到含有50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL庆大霉素及10 μg/mL四环素的10 mL抗性LB试管中，37 ℃、250 r/min 摇床培养过夜培养，提取重组Bacmid DNA。

以M13上下游引物对重组Bacmid DNA进行鉴定，反应体系为重组Bacmid DNA 2.0 μL，上下游引物(25 mmol/L)各 1.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA 酶(5 U/μL)0.5 μL，加双蒸水至25 μL。PCR反应条件：93 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，49 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 重组杆状病毒的获得与扩增 将重组Bacmid DNA转染处于对数生长的昆虫细胞Sf9，27 ℃培养，待Sf9细胞出现明显的病变(细胞核变大，细胞变大变圆，从瓶壁脱落)，收集上清即为P1代重组病毒。P1代重组杆状病毒滴度一般比较低，须要用P1代病毒继续传代提高滴度。将P1代病毒感染Sf9细胞，48 h后收集细胞上清，即P2代重组杆状病毒。以P2代病毒感染细胞，得到P3代重组杆状病毒。

1.2.6 重组蛋白的鉴定

1.2.6.1 SDS-PAGE和Western-blot试验 将P3代病毒感染Sf9细胞，正常Sf9细胞作为空白对照，待被感染细胞出现明显病变时，收集细胞沉淀。用适量磷酸缓冲盐溶液(PBS)重悬沉淀，与上样缓冲液混匀，煮沸10 min，进行 SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色、脱色，分析结果。

SDS-PAGE结束后，电转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉 4 ℃ 封闭过夜，加入1 ∶400稀释的一抗(MDPV多抗)，37 ℃孵育2 h，PBS洗涤5遍。加入1 ∶3 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育1.5 h，PBS洗涤5遍，而二氨基联苯胺(DAB)显色。

1.2.6.2 间接免疫荧光试验 将P3代病毒感染Sf9细胞，以正常Sf9细胞作为空白对照，48 h后，弃培养基上清，PBS洗涤。以预冷的甲醇固定10 min，PBS洗涤后，加入1 ∶400稀释的一抗(MDPV多抗)，37 ℃孵育1 h。加入1 ∶500稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗涤后，荧光显微镜下观察结果。

2 结果与分析

2.1 VP3基因的克隆

以处理的MDPV尿囊液为模板进行PCR扩增，经0.8%琼脂糖凝胶电泳，结果出现1条约1 602 bp大小的特异性条带(图1)，与预期结果相符。

2.2 转移载体pFastBac1-VP3的构建与酶切鉴定

将PCR扩增的VP3基因经琼脂糖凝胶分离后，切胶回收，用BamHⅠ和NotⅠ双酶切，与经同样酶切的pFastBac1质粒连接，获得转移载体pFastBac1-VP3。经BamHⅠ和NotⅠ双酶切得到约1.6 kb和4.7 kb的2条条带(图2)，与预期结果相符，且DNA测序结果证明VP3基因克隆正确。

2.3 重组Bacmid DNA的PCR鉴定

以M13上下游引物对重组Bacmid DNA进行PCR鉴定。由图3可知，重组质粒以M13为上下游引物时，出现大小约3.9 kb(2.3 kb+1.6 kb)的条带；以VP3-PFB-F、VP3-PFB-R为上下游引物时，出现大小约 1.6 kb 的条带，与预期结果相符。

2.4 重组蛋白的鉴定

2.4.1 SDS-PAGE分析 以P3代重组杆状病毒感染Sf9细胞，待细胞出现明显病变时，收集细胞，进行SDS-PAGE。染色脱色后，观察结果。由图4可知，被感染的Sf9细胞在约58 ku 处出现特异性条带，空白对照没有。

2.4.2 Western-blot检测 对重组蛋白进行Western-blot检测。由图5可知，重组蛋白在约58 ku处出现特异性条带，与预期结果相符。表明在Sf9细胞中表达的重组蛋白能与MDPV多抗发生特异性反应。

2.4.3 间接免疫荧光试验 以P3代重组杆状病毒感染Sf9细胞，待细胞出现明显病变时，以甲醇固定进行间接免疫荧光试验。由图6可知，P3代病毒感染的细胞出现较强的绿色荧光，而正常细胞中未见荧光。

3 讨论

番鸭细小病毒最早被报道是在1991年，林世堂等认为是类似小鹅瘟的番鸭病毒病的一种新病毒[1]，随后程由铨等分离到2株病毒，最后确定本病的病原是细小病毒科的一个新成员[7]。番鸭细小病毒的基因组为单链线性DNA，全长 5 136 bp，包含2个主要的开放阅读框(ORF)。左侧ORF编码非结构蛋白(NS)；右侧ORF编码病毒的3种结构蛋白(VP1、VP2、VP3)。其中VP3是主要的衣壳蛋白，约占总蛋白的80%，能刺激机体产生抗体[8-9]，是诱导机体产生保护性抗体的主要抗原[10]。

杆状病毒基因组较大，不易通过常规的酶切连接将外源片段插入其中，通常是将外源片段连接到转移载体上[11]，然后转移载体与杆状病毒重组，获得重组杆状病毒。最初重组杆状病毒构建时应用的是野生型病毒，该方法重组效率仅 0.1%～1.0%[12]，费事费力，因此在应用上有一定的难度。随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进，1993年 Bac-to-Bac技术问世。Bac-to-Bac技术是根据F因子载体原理，构建一种杆状病毒穿梭载体[13]，该载体既可像普通质粒一样在大肠杆菌中复制，又能感染昆虫细胞。该方法可使杆状病毒的最大重组率高达100%，并且操作简单，提高了工作效率。

本试验选择MDPV主要衣壳蛋白基因VP3，将其克隆至pFastBac1载体上，构建转移载体pFastBac1-VP3；转化DH10Bac感受态细胞，蓝白斑筛选及PCR鉴定后，获得重组Bacmid DNA。将重组Bacmid DNA感染昆虫细胞，制备重组杆状病毒rBac-VP3，并通过SDS-PAGE分析、Western-blot、间接免疫荧光试验检测重组蛋白的表达。结果证明，VP3基因能在杆状病毒系统中正确表达，为病毒样颗粒在昆虫细胞中的自主装配提供了有力条件和基础。