家蚕浅暗化型突变的初步探究

张 彦 石 凉 秦 凤 童晓琪 黄 浩 黄德辉

(安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥 230061)

暗化型(mln) 家蚕是家蚕体色突变中少见的全龄期表现黑化的突变：突变体幼虫头部、胸足、肛板等骨化部位均呈黑褐色，蛹后期为黑色，成虫期全身包括蛾翅在内都有明显的黑化现象[1-2]。有研究发现，该突变是由家蚕第18连锁群上的芳香烷基胺N-乙酰基转移酶基因(BmiAANAT)序列突变造成，突变基因编码的芳烷基乙酰转移酶(AANAT)失去了催化多巴胺形成N-乙酰基多巴胺的功能，致使多巴胺生成过量的黑色素，并随着表皮鞣化使暗化型家蚕幼虫和成虫呈现出黑化现象[3-4]；而正常型家蚕中催化多巴胺形成N-乙酰基多巴胺的功能主要由基因BmiAANAT与BmiAANAT2编码的酶来共同承担[5]。

暗化型家蚕被发现以后，安徽省农业科学院蚕桑研究所家蚕育种组的工作人员率先将突变的BmiAANAT基因导入到具有优良性状的实用品种中，利用暗化型家蚕成虫体色灰黑的特点，培育出黑白分明的双亲，把家蚕一代杂交种杂交率提高到99%以上，并组配了517(暗化型)×518及四元杂交种皖广三号(日系574、576为暗化型)等一系列家蚕杂交组合[6-9]。而且在品种培育过程中，工作人员发现暗化型品系580分离出了幼虫期头、胸足等骨化部位和蛹期后期、蛾期等发育阶段体色均比正常暗化型家蚕着色较浅的群体，为了便于区分，这些着色较浅的暗化型家蚕被命名为浅580。580与浅580家蚕个体除在着色上有差别以外，在虫体形态、眠起时间、虫蛹率等生理方面并没有差别。我们对家蚕品系浅580做遗传调查后发现：浅暗化蛾与正常白蛾杂交的F1代全部为正常白蛾，F2、BC1代正常白蛾与浅暗化蛾的分离比分别为3∶1和1∶1；浅暗化蛾自交的后代全部为浅暗化表型，表明浅暗化突变为隐性。

虽然暗化型家蚕的突变基因已被定位，黑色素合成代谢途径上的大部分基因也已经被解析，但暗化型家蚕的调控机制和对家蚕抗性方面的影响仍有不少未解之处[10]。浅580作为天然着色较浅的暗化型品系是研究家蚕暗化突变发生及调控机制的优良素材，对其发生原因的解析能进一步加强对暗化突变机制的认识。本试验在前人研究的基础上采用克隆基因全长序列和测定基因相对表达量的方式分析了BmiAANAT和BmiAANAT2与浅暗化型家蚕形成的关系，进而探究浅580的发生机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试家蚕 暗化型家蚕品系580、浅暗化型家蚕品系浅580，均由安徽省农业科学院蚕桑研究所家蚕育种组培育并饲养。

1.1.2 主要试剂 RNA反转录试剂盒(Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，6210B)、DNA Mark、荧光定量PCR试剂盒[TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)，RR420A]，均为宝生物工程(大连)有限公司产品；RNA提取试剂(Trizol Reagent)、琼脂糖B(A600014)，均为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 Lightcycle K型荧光定量PCR仪，杭州BIOER公司产品；Allegra 21R型台式高速冷冻离心机，美国BECKMAN公司产品；SIM-F140AY65型雪花状制冰机，日本SANYO公司产品；Hofer MV-25型紫外透射仪，美国Amersham Pharmacia公司产品；2.5 μL、10.0 μL、100.0 μL、1 000.0 μL规格的移液器，均为德国Eppendorf公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 家蚕暗化型突变体黑化程度的观察与比较 分别在幼虫期5龄第4天、蛹期末期、蛾期等发育阶段对家蚕品系580和浅580进行观察，并比较2个家蚕品系在各时期、各部位的黑化程度和着色深浅。

1.2.2 家蚕暗化相关基因BmiAANAT和BmiAANAT2的克隆分析 (1)“Trizol法”提取家蚕样品总RNA。家蚕品系580和浅580幼虫饲养到5龄第4天，分别随机挑选5头放入经过180 ℃高温烘干处理3 h的研钵内，加入液氮快速将材料研磨成粉末状，并称取100 mg加入1 mL Trizol Reagent后震荡混均，然后静置10 min使材料充分裂解。随后依照Trizol Reagent 试剂说明书步骤操作提取总RNA，提取的RNA样品用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测完整度，测定A260/A280、A260/A230的比值及浓度，最后将检测合格的样品总RNA于-80 ℃保存备用。(2)反转录合成cDNA。合成cDNA时使用宝生物工程(大连)有限公司生产的反转录试剂盒，依照说明书步骤进行操作。cDNA提取完成后，对样品浓度进行适当的稀释，以家蚕看家基因Actin3作为cDNA质量的检测基因。经检验合格的cDNA及时放入-20 ℃冰箱保存。(3)克隆分析。以暗化突变基因BmiAANAT(GenBank登录号：DQ256382.1)和BmiAANAT2(GenBank登录号：AK383501)全长序列设计引物(引物序列见表1)，来扩增2样品的暗化相关基因BmiAANAT和BmiAANAT2。PCR扩增反应总体积50 μL，扩增程序为94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min，反应结束控制在4 ℃，PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。把扩增的目的条带切下送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序的结果与基因BmiAANAT的突变类型1(GenBank登录号：GQ169236.1)、突变类型2(GenBank登录号：GQ169237.1)以及基因BmiAANAT2的全长序列进行分析比较。

表1扩增暗化基因BmiAANAT和BmiAANAT2全长的引物序列

引物名称上游引物(5′-3′)下游引物(5′-3′)BmiAGCGACACGGTCCCACGAACGATTCATTCAGACAACAACGATACBmiA2TGCTCGGCTCAAGGAGCGAGTTGTTTAACCGTGTTAAATATTTAT

1.2.3 家蚕暗化相关基因BmiAANAT和BmiAANAT2相对表达量的测定 (1)“Trizol法”提取家蚕样品总RNA。在蛹期第7 天随机挑选家蚕品系580和浅580各5头为试验材料，依照1.2.2(1)“Trizol法”提取家蚕样品总RNA项的方法和操作步骤分别提取总RNA。提取的样品总RNA经检验合格后于-80 ℃保存备用。(2) RNA反转录为cDNA及荧光定量PCR。基因组DNA去除、RNA反转录为cDNA及荧光定量PCR均依照说明书步骤进行操作。根据基因BmiAANAT和BmiAANAT2的序列设计对应荧光定量PCR引物和内参引物sw22934(表2)，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。试验数据采用2-△△Ct法[11]进行相对表达量的测定与分析。

表2暗化型相关基因BmiAANAT、BmiAANAT2和内参基因荧光定量PCR引物序列

引物名称上游引物(5′-3′)下游引物(5′-3′)(荧光标记)BmiATGAATCTCGCCGTCAATCTGGAAACTCCATCGCTCAAGGTAGBmiA2GTCTTTCAAAGCCGTCGAGTTTAGGATTGGGACATCGAAsw22934TTCGTACTGCTCTTCTCGTCAAAGTTGATAGCAATTCCCT

2 结果与分析

2.1 580及浅580黑化程度的观察与比较

对家蚕品系580及浅580幼虫期5龄第4天、蛹期末期、蛾期等发育阶段的观察发现，2个家蚕品系的黑化程度在各发育阶段均有明显的差异：幼虫期，580品系幼虫的头、尾板等骨化部位是黑褐色，而浅580品系骨化部位的颜色为淡褐色(图1-A)；蛹期末期，复眼刚着色时580品系蚕蛹的头、胸部已经有大量黑色素聚集沉淀，呈深黑色，而浅580品系蚕蛹上半部为淡黑色(图1-B)；蛾期，580品系雌、雄蛾全身为灰黑色，且一般雄蛾颜色较浅，但都比浅580品系的颜色深(图1-C)。这表明家蚕品系浅580的个体表皮聚集的黑色素含量比580的个体低。

A. 5龄第4天，B. 蛹期末期，C. 蛾期；红色箭头所示为各发育阶段的家蚕暗化型品系580。图1 幼虫期、蛹期、蛾期等发育阶段家蚕品系580与浅580的着色情况对比图

2.2 暗化相关基因BmiAANAT与BmiAANAT2的克隆与分析比较

如图2-A所示为扩增家蚕品系580与浅580暗化突变基因BmiAANAT全长序列的电泳图，在图中2个样品均扩增出了2条电泳带，测序后发现对应的电泳带所含DNA碱基序列相同：下面亮度较暗的1条，均含有1 253 bp碱基序列，与BmiAANAT突变类型1序列一致；上面亮度较高的1条，都含有1 407 bp碱基序列，且和BmiAANAT突变类型2序列相同。图2-B是扩增家蚕品系580与浅580的BmiAANAT2全长序列的电泳图，图中2个样品均扩增出单一电泳带，测序后发现这2条电泳带所含DNA碱基序列也相同。这表明家蚕品系580与浅580在暗化突变基因BmiAANAT突变类型方面是相同的，2个家蚕品系的BmiAANAT2也没有产生碱基序列突变；同时也说明浅580品系的浅暗化型表型不是由这2个基因的碱基序列突变造成的。

A. 基因BmiAANAT，B. 基因BmiAANAT2。图2 扩增家蚕品系580与浅580暗化相关基因BmiAANAT和BmiAANAT2全长序列电泳图

2.3 暗化相关基因BmiAANAT和BmiAANAT2相对表达量的测定与分析

图3所示为家蚕品系580与浅580暗化相关基因BmiAANAT和BmiAANAT2在蛹期第7天的相对表达量。在图3-A中，家蚕品系580暗化突变基因BmiAANAT的相对表达量约是家蚕品系浅580的8.3倍；如图3-B，家蚕品系580暗化突变基因BmiAANAT2的相对表达量也达到了家蚕品系浅580相对表达量的3.0倍。2个家蚕品系间，暗化突变基因BmiAANAT和BmiAANAT2的相对表达量均存在极显著的差异，且家蚕品系580的2个暗化突变基因的相对表达量均显著上调。推测BmiAANAT和BmiAANAT2的差异表达与家蚕品系浅580的形成有一定的内在联系。

A. 基因BmiAANAT的相对表达量，B. 基因BmiAANAT2的相对表达量；图中数据为平均值，**表示2个家蚕品系间基因BmiAANAT的表达量存在极显著差异(t检验，P<0.01)。图3 家蚕品系580与浅580暗化相关基因BmiAANAT和BmiAANAT2在蛹期第7天的相对表达量

3 小结与讨论

早在1961年就有了暗化型家蚕的报道[12]，从那时起科研人员对它的研究就没有停止过。TSUGEHARA等[13-14]克隆了基因BmiAANAT的cDNA全长序列，进一步研究表明其表达产物可以是乙酰化多巴胺、色胺、酪胺、真蛸胺等多种物质，但没有发现BmiAANAT的突变与暗化型家蚕之间的关联。直到中国科学院的詹帅等[15]和西南大学的代方银等[4]分别通过各自的研究把家蚕暗化突变基因确定为BmiAANAT基因才解析了暗化型家蚕的发生原因。朱勇等通过进一步研究在家蚕中鉴定出了另1条AANAT基因，将其命名为BmiAANAT2，并通过基因敲除技术证实该基因编码的酶也具有催化多巴胺形成N-乙酰基多巴胺的功能[5]。

基因BmiAANAT与BmiAANAT2编码的酶相似度高达57%，其共同的催化底物多巴胺是家蚕表皮硬化及黑色素代谢过程中的一种关键物质[5]。多巴胺由酪氨酸经酪氨酸羟化酶(TH)作用生成多巴(dopa)，再经多巴脱羧酶(DDC)的作用生成[16]，其在家蚕黑色素合成代谢途径上主要有3个去向：一是在N-β-丙酰多巴胺合成酶(NBAD synthase)的作用下与β-丙氨酸形成N-β-丙酰多巴胺(NBAD)，最后合成黄褐色的色素，NBAD在酶的水解作用下能分解成多巴胺和β-丙氨酸；二是在AANAT的作用下转化为N-乙酰基多巴胺(NADA)，NADA继续合成无色或透明的色素；三是在一系列酶的催化作用下生成深棕色的多巴胺黑色素[17-19]。BmiAANAT发生基因突变，编码无催化功能的AANAT从而使第2条途径受阻就是暗化型家蚕的发生原因。

本研究通过克隆基因BmiAANAT和BmiAANAT2的全长序列和测定其相对表达量来分析2个基因与浅暗化型家蚕形成的关系。克隆和测序结果显示，家蚕品系580与浅580所含BmiAANAT的突变类型是相同的，突变后的基因碱基序列与以前的报道一致；2个家蚕品系间BmiAANAT2的碱基序列也无差异。这表明家蚕品系浅580的发生不是由BmiAANAT和BmiAANAT2碱基序列突变造成的。

分析荧光定量PCR相对表达量结果时发现，2个家蚕品系间BmiAANAT和BmiAANAT2的相对表达量都存在极显著的差异，且家蚕品系580的2个暗化突变基因的相对表达量均显著上调。结合幼虫期5龄第4天、蛹期末期、蛾期等发育阶段580的个体都表现出比浅580的个体黑化程度更深的表型特征，可以推断家蚕品系580个体内的黑色素含量要明显高于家蚕品系浅580的个体，且家蚕品系580个体内黑色素的前导物多巴胺含量也应该高于家蚕品系浅580。浅580个体内含量较低的多巴胺诱导BmiAANAT，BmiAANAT2的表达量大幅下调，生成的多巴胺黑色素也明显下降，从而表现出浅暗化表型；但多巴胺含量偏低是由黑色素代谢通路上游的TH及DDC活性降低引起的，还是由通路下游的NBAD 合成酶的过量表达引起的，以及具体的调控机理都还需要进一步的研究和验证。