miR-19a调控BMPR2与VEGF在肺动脉高压大鼠肺血管重构中的作用

林志武，程生稞，付勇，杨齐，邓明彬

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

miRNA是一种无编码功能的单链RNA，主要干扰游离mRNA的翻译，实现转录后调控，参与调节细胞分化、增殖、凋亡，在肺动脉高压(PAH)形成中起重要作用[1]。miR-17-92基因簇能调节血管内皮生长因子(VEGF)，诱导肿瘤血管增殖，且能调控骨形成蛋白Ⅱ型受体(BMPR2)表达。目前研究已表明，BMPR2与其配体结合后能明显抑制血管平滑肌细胞的分化、增殖，与PAH形成密切相关[2,3]。miR-19a是miR-17-92基因簇最重要的成员之一，可诱导肿瘤血管形成及血管内皮增殖，但其作用机制尚不明确。2016年3月～2017年11月，本课题拟构建PAH动物模型，通过腺相关病毒(AAV)转染miR-19a相关序列实现差异性表达，观察miR-19a调控BMPR2与VEGF在PAH大鼠肺血管重构中的作用，为PAH的治疗提供新的靶点和手段。

1 材料与方法

1.1 主要材料 实验动物：健康雄性SD大鼠30只，6～8周龄，体质量180～200 g，均由西南医科大学动物实验中心提供。主要试剂及仪器：miR-19a AAV质粒(上海和元生物技术公司)；鼠抗BMPR2 IgG(1∶1 000，Bioworld)，鼠抗Tubulin IgG(1∶5 000，Proteintech)，HRP标记羊抗鼠IgG(1∶10 000，Proteintech)；总RNA提取试剂盒(上海华舜公司)，PCR试剂盒(北京天根生化科技公司)，逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)，BCA蛋白测定试剂盒(大连宝生物工程公司)。动物呼吸机(北京金洋万达科技公司)，电泳仪(上海天能科技公司)，PCR仪(Applied Biosystems)，荧光定量PCR仪(杭州博日科技公司)，凝胶成像系统(美国Biorad公司)，压力换能器(北京新航兴业科贸公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠PAH模型制备与分组转染处理 24只大鼠用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，固定气管导管接呼吸机，开胸切除左侧全肺，均PAH造模成功(8周后均出现饮食、活动耐量降低，呼吸频率升高，肺动脉管腔狭窄)。将模型大鼠随机分为P0、P1、P2、P3组各6只，另取6只仅左侧开胸作为假手术对照(C组)。P1、P2、P3组经气管分别导入滴度1×1012vg/mL的过载miR-19a AAV质粒、封闭miR-19a AAV质粒、空载miR-19a AAV质粒转染肺组织，P0、C组均经气管导入等量生理盐水。将各组分笼饲养于SPF级动物中心，喂养8周。

1.2.2 大鼠平均肺动脉压力(mPAP)测定 各组用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剪开胸骨。用充满肝素的头皮针穿刺肺动脉主干，链接压力换能器与生物机能实验系统，记录波形并计算mPAP。

1.2.3 肺动脉组织形态观察及肺细小动脉平均中膜厚度(MT)测算 取各组完整右肺，部分以4%多聚甲醛固定24 h；石蜡包埋，连续5 μm厚切片。常规苏木精伊红染色，在显微镜下观察肺动脉组织结构改变，计算MT。

1.2.4 肺组织中miR-19a、VEGF mRNA检测 采用实时荧光定量PCR法。TRIzol冰上裂解大鼠肺组织后快速提取总RNA,按逆转录试剂盒说明书操作得到cDNA，以此作为模板行实时荧光定量PCR。miR-19a、VEGF分别以U6、β-actin作为内参，引物均由生工生物工程有限公司合成(见表1)，以2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。

表1 miR-19a、VEGF及内参引物序列

1.2.5 肺组织中BMPR2蛋白检测 采用Western blotting法。将各组部分右肺组织置于含PMSF的裂解液中，4 ℃下以13 000 r/min离心5 min，取上清。BCA法测蛋白浓度，分别取20 μL蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，200 mA恒流转膜1 h。5%脱脂奶粉室温摇床封闭30 min，一抗4 ℃摇床过夜，次日1×TBST漂洗5 min×3次；二抗TBST稀释室温孵育1 h，1×TBST漂洗5 min×3次。将膜置于Super ECL Plus超敏发光液2 min，暗室中胶片曝光，最后显影、定影处理。扫描胶片后利用Quantity One图像分析软件分析条带灰度，以BMPR2与butulin条带灰度比值表示BMPR2蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组mPAP比较 C、P0、P1、P2、P3组mPAP分别为(15.36±2.31)、(26.42±1.32)、(33.57±2.85)、(20.10±0.94)、(25.74±1.31)mmHg,C组

2.2 各组肺动脉形态及MT比较 与C组比较，P0、P1、P2、P3组均有不同程度的内皮细胞结构紊乱,肺动脉中膜增厚、管腔狭窄；与P3组比较，P1组血管重构程度增强，而P2组血管重构程度减弱，P0组无明显变化。C、P0、P1、P2、P3组MT分别为5.4%±4.8%、20.1%±5.0%、35.1%±9.1%、13.4%±5.3%、18.4%±4.5%，C组

2.3 各组肺组织中miR-19a、VEGF mRNA表达比较 肺组织中miR-19a、VEGF mRNA表达C、P2组

表2 各组肺组织中miR-19a、VEGF mRNA表达比较

注：与C组比较，aP<0.05，bP<0.01；与P3组比较，cP<0.05，dP<0.01。

2.4 各组肺组织中BMPR2蛋白表达比较 C、P0、P1、P2、P3组肺组织中BMPR2蛋白分别为0.96±0.20、0.42±0.13、0.55±0.12、1.1±0.42、0.46±0.07，P0、P1、P3组低于C、P2组(P<0.05或<0.01)。

3 讨论

PAH是先天性心脏病最常见并发症之一，具有高发病率和高病死率的特点，异常血流动力学导致的血管内皮损伤、调节因子失衡是形成先心病肺动脉高压(CHD-PAH)的关键因素[4]，但其潜在的分子机制知之甚少，治疗方式局限。近年来，随着对miRNA的深入认识，其已成为PAH的研究热点。本实验采用单侧全肺切除构建肺内高血流状态，用于模拟先天性心脏病异常血流动力学，以探索PAH的发生发展过程并寻找潜在的治疗靶点。

本研究结果显示，在单侧全肺切除制备的PAH模型中miR-19a表达增加，表明miR-19a可能是PAH形成的重要调节因子,与陈伟丹等[5]的研究结果相符合。本实验将携带过载miR-19a、封闭miR-19a、空载miR-19a序列的AAV质粒通过呼吸道转染至PAH大鼠肺组织中，结果显示各组miR-19a表达出现明显差异；转染过载miR-19a后PAH大鼠mPAP、MT增加且肺血管重构加重，而转染封闭miR-19a后则出现相反的结果。这提示miR-19a对肺血管重构起重要调节作用，可能是miR-19a影响了血管平滑肌细胞、内皮细胞的增殖。

BMPR2蛋白是BMP信号通路的膜受体，与其配体结合后实现细胞内信号传导[6]，可调控肺动脉平滑肌细胞内效应蛋白的合成[7]，抑制平滑肌细胞等增殖，维持血管内稳态[8]。研究发现，诱导肺内皮细胞中miR-17-92的表达上调，能够明显减少BMPR2蛋白表达，导致BMP信号通路受损[9，10]。由于miR-19a是miR-17-92基因簇的一员，查询基因库后发现BMPR2基因序列3′UTR端能与miR-19a的碱基序列互补，因此推测miR-19a能调控BMPR2的表达。本研究结果显示，封闭miR-19a后PAH大鼠肺组织中BMPR2蛋白表达增加、MT降低。这表明封闭miR-19a可以促进BMPR2蛋白表达，并且激活BMP信号通路，抑制平滑肌细胞增殖能力，从而改善肺血管重构，降低mPAP。而转染过载miR-19a后，PAH大鼠肺组织中BMPR2蛋白表达降低，mPAP、MT升高；但与空载miR-19a大鼠比较，并未观察到BMPR2蛋白进一步下降。这可能与BMPR2蛋白表达和生物活性与蛋白泛素化、溶酶体酶降解以及受多种miRNA调控等因素有关[11～13]，其机制还需进一步研究。

VEGF是一种强效促血管生成因子，而miR-17-92簇可增强VEGF促进内皮增殖、新生血管形成[3]。本研究结果显示，过载miR-19a后PAH大鼠肺组织中VEGF mRNA表达升高、肺血管重建明显，而封闭miR-19a后结果则相反。这表明miR-19a可调节VEGF表达影响血管内皮细胞的增殖活性，但VEGF引起细胞反应受多种因素的影响[14，15]。有研究表明，平滑肌细胞的增殖效应也可促进VEGF在自身中的表达，进而加重血管重构[16]。本实验结果显示，当BMPR2表达降低时，VEGF mRNA表达量上升，两者具有相反的趋势。由此我们推断，BMPR2表达减少后所导致的平滑肌细胞增殖，可能一定程度激活了VEGF表达，促进血管重构，从而增加了肺血管阻力。

综上所述，miR-19a能通过负性调控BMPR2的表达，影响肺动脉平滑肌的增殖及凋亡，同时又能调控VEGF，促使血管内皮细胞的增殖，而BMPR2又与VEGF间可能存在相互作用的关系，在PAH形成过程中起关键作用，为CHD-PAH的临床研究及治疗提供了新的靶点。