不同产地野生桑黄中总黄酮含量比较

胡碧辉

宁波市奉化区中医医院，浙江 宁波 315500

桑黄又名桑臣、桑耳、胡孙眼、桑黄菇等，始载于《神农本草经》，早在两千多年前就已经作为名贵中药材使用[1]。桑黄可利五脏、软坚、止血、活血、和胃止泻，主治淋病、崩漏带下、癥瘕积聚、癖饮、脾虚泄泻。现代医学研究证实，桑黄在抗肿瘤、提高机体免疫力、保护肝脏等方面均具有确切的疗效[2～4]，起效的物质基础多指向黄酮和多糖两类物质，而总黄酮的含量影响着桑黄的质量[5]。野生桑黄素有“森林黄金”之称，随着桑黄被越来越多的人追捧，野生桑黄的数量正在急剧减少。桑黄在我国东北、华北、西北、华东等地均有分布，地域环境不同，桑黄的质量也存在差异，本研究以总黄酮含量为观察指标，比较全国6个主要产地野生桑黄的质量，以期能为野生桑黄的保护和合理开发提供依据。

1 仪器、试剂与药品

1.1 仪器 UV-1800紫外分光光度计(岛津公司)；HH.S11-4型电热恒温水浴锅(上海博讯医疗生物仪器股份有限公司)；XS205十万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；ME4002T百分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-250GTDV型超声波清洗器(上海精密仪器仪表有限公司)；KDM型电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)；XL-04B摇摆式粉碎机(广州市旭朗机械设备有限公司)；RE-52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-B95型真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；BT300-2J恒流泵(保定兰格恒流泵有限公司)。

1.2 试剂与药品 芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量92.6%，批号：100080-201610)；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；水为超纯水(自制)；AB-8型大孔吸附树脂(沧州宝恩化工有限公司)；野生桑黄为2017年10—11月分别采自吉林长白山、山东夏津、西藏昌都、云南临沧、安徽金寨、四川甘孜6地，经浙江中医药大学张水利教授鉴定为多孔菌科真菌火木层孔菌Phellinus igniarius(L.exFr.)Quel.的子实体。

2 研究方法与结果

2.1 总黄酮的提取及纯化[6～7]取桑黄200 g，置摇摆式粉碎机中粉碎成中粉，混合均匀，取20 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入70%乙醇500 mL，浸泡30 min，回流提取60 min，滤过，收集滤液，用70%乙醇100 mL洗涤滤渣，合并滤液，置于旋转蒸发器中回收乙醇至无醇味，备用。取100 g经预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱(2.7 cm×16 cm)。将上述备用样品上柱，静置1 h，先用3 BV的纯化水洗脱，再用5BV 70%乙醇以2 BV/h的流速洗脱，收集乙醇洗脱液，加70%乙醇定容至500 mL，摇匀，即得纯化后的桑黄总黄酮。

2.2 对照品溶液制备 取芦丁对照品约20mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至100 mL，摇匀，即得浓度为0.2104mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 分别取不同产地的桑黄，按照2.1项下方法制备桑黄总黄酮液，然后精密量取10 mL，置于100 mL量瓶中，用70%乙醇稀释至100 mL，摇匀，即得。

2.4 线性范围考察[8]精密吸取对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于25 mL量瓶中，各加70%乙醇至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，加乙醇至100 mL，摇匀，放置15 min，以第1管作为空白，在507 nm处测定吸光度，结果见表1。以芦丁量(mg)为横坐标，以吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.635X-0.048，r=0.998 9。结果表明，芦丁在0.210 4～1.052 0 mg范围内线性关系良好。

表1 芦丁标准曲线绘制

2.5 精密度试验 精密吸取芦丁对照品溶液3.0 mL，按照2.4项下方法操作，重复测定6次，RSD=0.15%，结果见表2。结果表明，仪器精密度良好。

表2 精密度试验

2.6 稳定性试验 精密吸取供试品溶液3.0 mL，按照2.4项下方法操作，每隔10 min测定1次吸光度，连续测定6次，RSD=0.18%，见表3。结果表明，供试品溶液显色后在50 min内稳定性良好。

表3 稳定性试验

2.7 重复性试验 精密吸取供试品溶液3.0 mL，共6份，分别按照2.4项下方法操作，测定吸光度，结果见表4。结果表明，本含量测定方法重复性良好。

表4 重复性试验

2.8 加样回收率试验 精密吸取供试品溶液(黄酮含量：0.240 3mg/mL)1.5 mL，共6份，分别置于25 mL量瓶中，精密加入芦丁对照品溶液(0.210 4 mg/mL)1.7 mL，其余按照2.4项下方法操作，测定吸光度，计算加样回收率，结果见表5。结果表明，本含量测定方法回收率良好。

表5 加样回收率试验

2.9 不同产地桑黄总黄酮含量测定 取不同产地的桑黄，按2.1项下方法制备黄酮提取液，按照2.4项下方法操作，测定吸光度，计算总黄酮含量，结果见表6。结果表明，不同产地的桑黄总黄酮含量不同，含量为37.6～62.2 mg/g不等。从收集到的样品来看，吉林长白山、西藏昌都所生的桑黄总黄酮含量较高，云南临沧、四川甘孜所生的桑黄总黄酮含量略低。

表6 不同产地桑黄总黄酮含量测定(n=3)

3 讨论

桑黄子实体坚硬，在粉碎前需要先用斧头砍成小块，才能有利于摇摆式粉碎机粉碎。试验过程中，笔者对比了热回流提取和超声提取，结果显示，热回流提取能充分地对黄酮进行提取，而超声提取率仅为73%，分析原因为桑黄子实体的组织和细胞坚实而又具有一定的韧性，超声引起的溶剂分子空爆不足以破坏组织和细胞，导致内部的黄酮提取率较低，而回流提取热溶剂的穿透性和溶解性大大提升[9]，确保提取充分。

紫外分光光度法较高效液相色谱法有优势，可以利用一种对照物质来测定一大类物质的含量，而且测试成本更低；但紫外分光光度法较高效液相色谱法也有劣势，即显色机理的专属性差，供试品中的其他成分容易干扰显色反应，从而影响测试结果的准确度，因此，为提高检测的准确性，应采用理化手段提高待测组分的纯度[10]。而黄酮纯化最常用到的AB-8型大孔吸附树脂，可将黄酮提取液的纯度由20%提升到60%，大大提高了检测的准确性。

近些年掀起的桑黄热导致野生桑黄的价格一路飞涨，部分地区寻采野生桑黄者趋之若鹜，使得本就数量不多的野生桑黄越来越少。随着现代微生物培养技术的进步，已经可以实现桑黄子实体的人工培育，但是限于技术的成熟度而未能推广[11]。农林等相关部门应助力桑黄人工培育的发展，从根本上解决桑黄药源问题。除此之外，还应当出台相应的政策加强对野生桑黄的保护，禁止滥采，这将有助于野生桑黄的自然繁育和规模的扩大。

不同产地的野生桑黄总黄酮含量有差异，这与不同产地的温度、光照、水分、土壤等因素有密不可分的关系[12]。黄酮含量的高低，仅可作为桑黄质量评价的标准之一，若要全面地评价桑黄质量，还应当对多糖、三萜、微量元素等展开系统的研究。