电针天枢穴对溃疡性结肠炎大鼠TLR4/NF-κB信号通路的影响

李皓月，梁浩

1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036

溃疡性结肠炎(Ulcertive colitis，UC)又称为慢性非特异性炎症性肠病，是一种慢性持续性、反复发作的肠道炎症性疾病[1]。本病好发于直肠及乙状结肠，甚至可延伸至整个结肠，其病变部位多局限于肠道黏膜和黏膜下层，临床以腹痛、腹泻和黏液样脓血便为主要特征[2]。研究发现，Toll样受体4(Toll-like receptors，TLR4)能够通过髓样分化初级反应88(Myeloid differentiation primary response 88，MyD88)蛋白激活核因子κB(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB)信号通路，并促进下游炎性细胞因子的分泌，从而诱导UC的发病及发展[3]。针灸治疗本病具有广阔的发展前景和独特的优势，不仅效果理想，而且不良反应少，安全性高，易被广大患者的接受[4]。然而目前对于针灸治疗本病的作用机制尚不明确，因此本研究通过电针对比假电针组及柳氮磺胺吡啶(SASP)组，观察TLR4/NF-κB信号通路中相关蛋白及mRNA的表达来探讨电针的具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 75只雄性Wistar大鼠，体质量(210±15)g，购自哈尔滨医科大学实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(黑)2013-0002，动物随机分成空白组、模型组、电针组、假电针组和SASP组，每组15只，大鼠分笼饲养，自由摄食及饮水，每天定时清洁笼舍。饲养于温度22～25℃，相对湿度55%～75%，12 h昼夜循环照明的环境中。

1.2 药物及试剂 2，4，6三硝基苯磺酸溶液(2，4，6-Trinitrobenzene sulfonicacid solution，TNBS)美国 Sigma公司生产。无水乙醇、水合氯醛，上海基免生物科技有限公司生产；柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine，SASP)，上海三维制药有限公司生产；BCA蛋白定量试剂盒，美国Sigma公司生产；Trizol RNA提取试剂盒，美国Inviyrogen公司生产；白细胞介素-1β(Interleuki-1β， IL-1β)、 肿 瘤 坏 死 因 子 -α (Tumor Necrosis Factor，TNF-α)、白细胞介素 -10(Interleuki-10，IL-10)酶联免疫分析试剂盒，美国R&D Systems公司生产；TLR4、MyD88、NF-κB p65及β-actin兔抗鼠单克隆抗体，上海康朗生物科技有限公司生产；山羊抗兔二抗，美国Licor公司生产；TLR4、MyD88、NF-κB p65及β-actin基因引物由上海生工生物工程公司生产；一步法RT-PCR试剂盒，天根生化科技有限公司生产。

1.3 仪器 3-18KS台式高速冷冻离心机(Sigma，USA)，902-ULTS超低温冰箱(Thermo，USA)，HBS-1096A酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)，半干式转膜槽、Mini-PROTEAN Tetra电泳槽(Bio-Rad，USA)，Tanon 1600全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)，T100 PCR仪(Bio-Rad，USA)，0.25 mm×25 mm一次性使用无菌针灸针(贵州安迪药械有限公司)，KWD-808脉冲针灸治疗仪(常州英迪电子医疗器械有限公司)，CX41光学显微镜(Olympus，Japan)。

1.4 模型制备 除空白组外，余下4组大鼠均按照徐阳等[5]的方法制造大鼠UC模型。造模前大鼠禁食24 h，禁水2 h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，模型组、电针组、假电针组和SASP组大鼠采用灌胃针轻插入肛门深约8 cm处，一次性灌入TNBS混合液(50%乙醇0.25 mL+TNBS原液100 mg/kg)，空白组灌入等体积的0.9%的氯化钠注射液。结束后将大鼠肛门捏紧并提尾倒立10 min，放回饲养笼中。

1.5 干预方法 造模结束后开始干预治疗。空白组不做任何干预，只做相同的抓取固定。电针组给予针刺双侧“天枢穴”，天枢穴参照《实验针灸学》中定位标准，假电针组给予针刺双侧“天枢穴”旁开1寸，针刺后连接电针仪，频率10～20Hz，电流强度2～4 mA，针刺时间为30 min，每天治疗1次。SASP组以10 mL/kg SASP悬浊液灌胃治疗，模型组给予等体积的0.9%氯化钠注射液灌胃治疗，每天1次。

1.6 标本采集 连续治疗10天后，大鼠禁食24 h用10%水合氯醛再次腹腔注射麻醉后，开腹，腹主动脉取血，静置2 h，2 500 r/min离心5 min，取上清液置于-70℃冰箱中保存进行ELISA检测。取结肠组织6 cm，剪取1 cm×1 cm病变结肠组织后后固定于10%福尔马林溶液中24 h，酒精脱水，石蜡包埋，常规切片后进行苏木精-伊红(HE)染色，余下结肠组织置于-70℃冰箱中保存，用于Western-blot及RT-PCR检测。

1.7 观察一般情况及检测指标 分别观察各组治疗后大鼠的体质量、毛发光泽度、精神状态、大便性状及活动的情况。根据文献[6]制定的DAI评分标准，分别评价各组大鼠治疗后UC疾病活动情况。光学显微镜下观察各组大鼠结肠组织病理学形态，HE染色按照试剂盒说明书严格操作。测定各组大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-10的水平，检测方法严格按照ELISA说明书操作步骤。

(1)取20 mg结肠组织粉碎后加入RIPA裂解液及PMSF后电动均浆，BCA法蛋白质浓度测定，SDS-PAGE分离蛋白质，转移至PVDF膜后3%BSA室温封闭。加入TLR4、MyD88、NF-κB p65 一抗(1∶2 000)，β-actin 作为对照(1∶10 000)，孵育过夜后洗涤加入HRP标记的二抗后孵育1 h。(2)Image J软件分析Western blot结果，以TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白与β-actin内参的比值表示目标蛋白的相对表达量。(3)取20 mg结肠组织粉碎后均浆，按Trizol试剂盒方法提取RNA琼胶糖电泳以确定RNA的完整性后进行RNA纯度和浓度的检测。合成相关引物，TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA引物序列见表1。

(1)逆转录合成cDNA，于PCR管中加入标本RNA 5 μg，随机引物 1 μL，RNase free ddH2O 5 μL，混匀后 70℃水浴5 min，冰浴10 s，离心，加入5×Reaction Buffer 4 μL，RNA酶抑制剂 1 μL，dNTP 混合物 2 μL，AMV 逆转录酶 2 μL，37℃水浴5 min，42℃水浴60 min，70℃水浴10 min后终止反应，-20℃保存。(2)以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为预变性95℃2 min后进行循环；95℃20 s，60℃25 s，72℃30 s，45个循环，将PCR产物在琼脂凝胶中进行电泳，紫外灯下照相，凝胶图像分析系统进行吸光度扫描，以TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA条带与GADPH条带的比值表示目标基因的相对表达量。

表1 TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA 引物

1.8 统计学分析 用SPSS20.0统计学软件进行统计分析，各组计量数据均以(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析法，组间两两比较采用Q检验(LSD法)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 见图1A。与空白组比较，模型组及假电针组大鼠体质量下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)；模型组大鼠皮毛枯黄无光泽，精神萎靡、蜷缩而卧，出现黏液样脓血便；电针组和SASP组大鼠体质量、毛发光泽度、精神状态、大便性状等情况均有不同程度的改善，其中电针组优于SASP组。

2.2 各组大鼠DAI评分结果比较 见图1B。与空白组比较，模型组大鼠DAI评分显著升高(P＜0.05)；与模型组比较，假电针组差异无统计学意义，电针组和SASP组DAI评分显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与SASP组比较，电针组DAI评分较低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 各组大鼠体质量及DAI评分结果比较

2.3 各组大鼠结肠组织HE染色结果比较 见图2。空白组结肠黏膜表面光滑，上皮完整，固有层无炎性细胞，黏膜下层未见充血、水肿及炎性细胞浸润；模型组及假电针组结肠黏膜表面无上皮覆盖，黏膜层隐窝坏死，伴溃疡形成累及各层肠壁。电针组和SASP组结肠黏膜可见部分杯状细胞及腺体，仍存在炎性细胞浸润，溃疡程度较模型组显著改善，其中以电针组改善最为明显。

2.4 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-10检测结果比较 见图3。与空白组比较，模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量显著增高，IL-10含量显著降低(P＜0.05)。与模型组比较，电针组、SASP组血清IL-1β、TNF-α含量显著降低，IL-10含量显著增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而假电针组差异均无统计学意义(P＞0.05)。与SASP组比较，电针组IL-1β含量较低、IL-10含量较高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，TNF-α含量差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.5 各组大鼠结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达结果比较 见图4。与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白的表达显著增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，电针组、SASP组大鼠结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白的表达显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，假电针组差异均无统计学意义(P＞0.05)。与SASP组比较，电针组大鼠结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白均较低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.6 各组大鼠结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达结果比较 见图5。与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA的表达显著增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，电针组、SASP组大鼠结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA的表达显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，假电针组差异均无统计学意义(P＞0.05)。与SASP组比较，电针组大鼠结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA差异均无统计学意义(P＞0.05)。

图2 各组大鼠结肠组织HE染色结果比较 (×100)

图3 各组大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-10检测结果比较

图4 各组大鼠结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达结果比较

图5 各组大鼠结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达结果比较

3 讨论

Toll样受体(TLRs)属于跨膜蛋白受体，由胞内段、跨膜区和胞外段组成，其中胞内段由长短不一的短尾肽和Toll同源结构域组成。TLRs能够识别脂蛋白、脂多糖、病原微生物，从而激活免疫系统，刺激细胞因子的释放和刺激分子的表达，是先天性免疫识别系统的重要组成部分[7]。TLR4分布于除B细胞、T细胞和NK细胞以外的免疫细胞中，能够介导肠上皮细胞对细胞壁中脂多糖的高反应性，还能在辅助因子的参与下激活下游的信号转导分子，参与炎症反应[8]。研究发现TLR4能够非特异性的结合病原相关分子，介导信号通路的转导参与UC的发病，从而促进肠道炎症的释放[9]。MyD88是TLRs胞内段的接头蛋白，TLR4介导的MyD88依赖性途径能够通过激活NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)参与炎症反应，在TLR信号通路中起着关键的作用。陈晓等[10]研究发现，UC模型大鼠结肠组织中MyD88的表达较正常对照组大鼠显著增高，且MyD88的水平与肠道炎症程度呈正相关。NF-κB作为核转录因子，具有多种生物活性，而其介导的NF-κB信号转导通路能够参与机体的免疫炎症反应。NF-κB在正常状态下以复合物的形式存在于细胞质中，细胞外信号通过磷酸化的形式激活IκB激酶，活化NF-κB，分泌IL-1β、TNF-α、iNOS、VCAM-1等多种炎症介质及因子，从而诱导UC的发生与发展[11]。

UC属于中医肠澼、泄泻、久痢的范畴，本病多由外感风、寒、湿邪，或是起居失常，或饮食不洁或不节，导致湿浊困阻中焦，耗伤脾胃，淤而热化，下注大肠，阻碍气机运行以致血瘀。因此本病以湿热、血瘀为主要病机，然而湿热之邪，缠绵不愈。针灸疗法作为祖国传统医学的瑰宝，在UC的治疗方面取得了良好的临床疗效。刘朝等[12]通过对近15年针灸治疗UC的临床随机对照试验数据进行统计发现，天枢穴使用频率为13.54%，为治疗UC的第二大要穴。天枢穴隶属于足阳明胃经，位于脐旁2寸，左右各一，为大肠治募穴。天枢穴具有消食导滞、疏调肠腑、化瘀止痛的功效，正如《针灸大成》中记载“脾泄之症别无他，天枢二穴刺休差”。《医宗金鉴·刺灸心法要诀》谓“天枢穴，主治主治内伤脾胃，赤白痢疾，脾泻及脐腹鼓胀，癌瘕等证”。现代研究发现，电针天枢穴不仅能够显著改善UC大鼠结肠黏膜病理组织形态学，还能够显著上调组织中热休克蛋白-70和抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的表达，从而有效控制炎症及免疫级联反应[13]。

为进一步明确针灸治疗UC的具体作用机制，本研究通过TBNS/乙醇制造UC模型，以假电针组及SASP为双向对照，研究结果发现，造模后模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量及结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白及mRNA的表达显著增高，IL-10含量显著降低；干预治疗后，电针组及SASP组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量及结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白及mRNA的表达显著降低，IL-10含量显著增高，且电针组在血清IL-1β、IL-10含量及结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达方面，明显优于SASP组，在血清TNF-α的含量及及结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA的表达方面，2组间比较未见明显差异性。此外，假电针组不仅不能改善UC的一般状况及结肠黏膜形态，而且在血清IL-1β、TNF-α、IL-10含量及结肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白及mRNA的表达方面，与模型组比较，差异无统计学意义，说明电针刺激本身对UC病变无明显疗效，进一步说明腧穴在治疗本病中的特异性。

综上，电针天枢穴能够明显改善UC大鼠的结肠组织病理学形态，降低DAI评分，治疗UC，其作用机制是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的活化实现的。