跨膜蛋白39A基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价

李向茸，王兴陇，2，李 倩，2，马瑞仙，2，张海霞，李琼毅，2，马忠仁，冯若飞，*

(1．西北民族大学生物医学研究中心，甘肃兰州730030;2．西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030)

跨膜蛋白39A(Transmembrane protein 39A，TMEM39A)是一种多通道膜蛋白，与跨膜蛋白39B同属于跨膜蛋白39家族，这2种亚型由可变剪接形成［1］。跨膜蛋白镶嵌于细胞膜两端，它作为通道或装运码头来支配相关分子在生物膜上的运输或进入，也可将产生的副产品运出细胞［2］。Park 等［3］的研究表明，TMEM39A 的 mRNA含量在胶质瘤组织和细胞样本中明显上调，推测TMEM39A可能作为一种新的诊断标志物和治疗靶点在神经胶质瘤和其他癌症的治疗中发挥作用。针对TMEM39A的深入研究可以为临床治疗某些自身免疫疾病、肿瘤和癌症等提供新思路。目前，针对TMEM39A的检测方法国内外均无相关报道，本研究建立了 TMEM39A基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法，为进一步研究TMEM39A的生物学功能及与其他蛋白的相互作用奠定了一定的基础，同时在临床上也为与TMEM39A相关的某些疾病的预防及治疗提供了一种快速检测和定量分析技术。

1 材料与方法

1．1 细胞、菌株及质粒

人皮肤鳞癌细胞(A431)、叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)、大鼠脑胶质瘤细胞(C6)、小鼠成肌细胞(C2C12)、甘加羊肾细胞(GJY)、人胚肾细胞(HEK293)、人宫颈癌细胞(HeLa)、粉纹夜蛾卵巢细胞(Hi-5)、河曲马睾丸细胞(HQM)、人肝癌细胞(HuH-7)、牛肾细胞(MDBK)、犬肾细胞(MDCK)、人胚肺成纤维细胞(MRC-5)、猪肾细胞(PK15)、草地夜蛾卵巢细胞(Sf9)、猪睾丸细胞(ST)、非洲绿猴肾细胞(Vero)均由甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供;大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21感受态细胞购自生工生物工程(上海)有限公司;pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司;pMD18-T-TMEM39B、 pMD18-T-TMEM43 及pMD18-T-IFITM2克隆载体均由生物工程与技术国家民委重点实验室提供。

1．2 主要试剂

DMEM高糖培养基、胰蛋白酶购自兰州百灵生物技术有限公司;胎牛血清购自兰州民海生物工程有限公司;细胞总RNA提取试剂盒、M-MLV及质粒小提试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司;DNA凝胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;Xho I内切酶、Not I内切酶及LA Taq聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司;SYBRSelect Master Mix购自美国 ThermoFisher Scientific公司。

1．3 引物设计与合成

根据 GenBank中的 TMEM39A基因序列(BC021277.2)，利用 Primer Premier 5.0设计 1对扩增TMEM39A全长开放阅读框(ORF)的常规PCR引物和1对荧光定量通用性引物，选取不同种属TMEM39A基因的保守区域设计荧光定量引物，由宝生物工程(大连)有限公司合成(表1)。

1．4 TMEM39A质粒标准品的制备

提取HEK293细胞总RNA，采用两步法反转录合成cDNA。以此cDNA为模板，用常规PCR引物进行PCR，扩增全长TMEM39A基因片段。PCR反应条件为:94℃ 5 min;94℃ 30 s，59℃60 s，72 ℃ 2 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化PCR产物，将其克隆于pMD18-T载体上，构建重组克隆质粒pMD18-T-TMEM39A。进行酶切和测序鉴定，测定重组质粒的浓度，计算每μL质粒含有的拷贝数，将该质粒标准品命名为TMEM39A-Standard。

表1 引物序列Table 1 Nucleotide sequences of the primers

1．5 TMEM39A荧光定量 PCR方法的建立及优化

采用SYBR GreenⅠ染料法，利用合成的荧光定量PCR通用性引物TMEM39A qF/R，在ABI荧光定量PCR仪上进行扩增和结果分析。以Ct值最小和荧光值最高及溶解曲线不出现非特异性扩增产物为标准，分别对引物浓度(5、10、15、20 μmol·L－1)、退火温度(55、56、57、58、59、60、61、62℃)等条件进行优化，建立TMEM39A基因的荧光定量PCR反应。

1．6 标准曲线的绘制

将TMEM39A-Standard进行10倍倍比稀释，分别取 3.937 ×108、3.937 ×107、3.937 ×106、3.937 ×105、3.937 ×104、3.937 ×103拷贝·μL－16个浓度梯度的质粒作为模板，依照上述优化的TMEM39A SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件进行扩增。以相应拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线。待荧光定量PCR的反应结束后，继续对反应产物进行加热，温度升高至95℃，反应15 s，接着温度降低至65℃，反应1 min，DNA双链复性，荧光分子绑定在DNA双链上，所以荧光信号值到达最高点。从65℃缓慢升温至95℃，持续记录此时的荧光信号变化量，然后以温度作为横坐标，单位时间内荧光信号的变化量为纵坐标绘制溶解曲线。如果溶解峰是单一的，表示产物扩增特异;反之，则意味有非特异性扩增。

1．7 特异性试验

分别以本实验室构建的质粒浓度均为3.937×107拷贝·μL－1的其他3种跨膜蛋白阳性克隆载体 pMD18-T-TMEM39B、 pMD18-T-TMEM43、pMD18-T-IFITM2及TMEM39A-Standard为模板，采用上述反应体系和条件，分别进行荧光定量PCR，检测该方法的特异性。

1．8 敏感性试验

取3.937×108～3.937×101拷贝·μL－18个浓度梯度的TMEM39A-Standard分别作为模板，进行荧光定量PCR，以确定本方法的检测下限。同时采用常规PCR方法进行检测［12］，比较2种方法的敏感性。

1．9 重复性试验

随机选取3个浓度(3.937×107、3.937×106、3.937×103拷贝·μL－1)的 TMEM39A-Standard分别作为模板，进行荧光定量PCR。组内和组间试验各做3次重复，评价本方法的重复性。

1．10 不同种属细胞样品检测

分别提取人源、猪源、猴源、鼠源、犬源、羊源、马源、牛源及昆虫细胞等18种不同细胞的总RNA，反转录后利用上述建立并优化的TMEM39A SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法进行检测，分析试验结果。

2 结果与分析

2．1 TMEM39A质粒标准品的制备与鉴定

TMEM39A基因扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，在1.5 kb处可见一条特异性条带，大小与预期一致(图1-A)。重组质粒pMD18-TTMEM39A经XhoⅠ、NotⅠ双酶切后，出现2条清晰的条带，约为2.6 kb和1.5 kb，与预期相符(图1中B)。测序结果与BC021277.2参考序列进行比对，核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.9%和99.8%，为特异性目的序列，表明TMEM39AStandard质粒标准品构建成功。测得该质粒浓度为650 ng·μL－1，根据拷贝数计算公式得出对应的拷贝数为3.937 ×1011拷贝·μL－1。

2．2 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件的优化

经条件优化最终确定的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应体系为:SYBRSelect Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，TMEM39A qF/R(10 μmol·L－1)各 1.0 μL，模板 2.0 μL。反应条件为:95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40次循环。根据扩增曲线得出最佳的引物使用浓度为10 μmol·L－1，最佳退火温度为 58 ℃。

2．3 标准曲线的绘制

图1 TMEM39A基因PCR扩增(A)及重组质粒pMD18-T-TMEM39A的酶切鉴定(B)Fig．1 Identification of TMEM39A gene and its recombinant plasmid pMD18-T-TMEM39A

将TMEM39A-Standard进行倍比稀释后，取6个浓度梯度进行荧光定量PCR。标准曲线方程Y= －3.564logX+45.706，相关系数(r)为0.999，在3.937×108～3.937×103之间Ct值与质粒浓度呈现良好的线性关系(图2-A)，且扩增效率为90.813%，满足要求(r＞0.99，110＞Eff% ＞90)，表明标准曲线建立成功。在溶解温度为(80±1)℃处出现单一的特异性峰，无非特异性扩增及引物二聚体出现(图2-B)。

2．4 特异性

分别以本课题组构建的 pMD18-TTMEM39B、pMD18-T-TMEM43、pMD18-T-IFITM2及TMEM39A-Standard为模板，采用本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法进行扩增，结果显示，除TMEM39A-Standard能够出现特异性扩增外，其他跨膜蛋白均不产生扩增。表明该方法特异性较好(图3)。

2．5 灵敏度

分别以 3.937 ×108、3.937×107、3.937 ×106、3.937 × 105、3.937 × 104、3.937 × 103、3.937×102、3.937×101拷贝·μL－18个浓度梯度的TMEM39A-Standard作为模板，进行荧光定量PCR以及常规PCR扩增，比较2种方法的检测下限。本方法能检出的最低模板浓度为3.937×102拷贝·μL－1(图4-A)，而普通PCR方法的检测下限为3.937×104拷贝·μL－1(图4-B)，表明本方法的敏感性较高，比常规 PCR灵敏度高100倍左右。

2．6 重复性

图2 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线(A)和熔解曲线(B)Fig．2 The standard curve(A)and melting curve(B)of SYBR Green Ⅰ real-time PCR amplification for TMEM39A gene

图3 引物TMEM39A qF/R的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR特异性Fig．3 Specificity of primers TMEM39A qF/R by SYBR GreenⅠreal-time PCR amplification

以3个浓度梯度的TMEM39A-Standard进行3次组内及3次组间重复测定，由统计分析结果可知，其组内变异系数为0.121% ～0.169%，组间变异系数为0.285% ～0.950%，均小于1.0%(表 2)，表明本研究建立的 TMEM39A SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有良好的重复性和稳定性。

2．7 不同种属细胞样品检测

以本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 方法对 HEK293、C6、ST、MDCK、MRC-5、HeLa、BHK-21、MDBK、SF9、HuH-7、Vero、CHOK1、GJY、Hi-5、A431、PK15、C2C12、HQM 细胞的cDNA进行检测。结果显示，不同种属的细胞样品中均能检测到TMEM39A基因，但含量不同，HeLa细胞中的 TMEM39A含量最高，其次为HEK293细胞，HQM细胞中TMEM39A基因含量最少(图5)，表明该方法可用于不同种属样品细胞中TMEM39A基因的检测。

图4 引物TMEM39A qF/R的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR与常规PCR灵敏性试验Fig．4 Sensitivity detection of primers TMEM39A qF/R by using series plasmid dilutions with real-time PCR and PCR

3 讨论

目前，有关TMEM39A基因的研究较少，仅发现其在某些自身免疫疾病、肿瘤和癌症的治疗中发挥作用［4－11］，而且国内外针对 TMEM39A 的检测方法尚处空白。基于此，快速、准确检测TMEM39A在细胞或者组织中的含量变化对于某些自身免疫疾病、肿瘤和癌症等的诊断及治疗尤为重要。通过基因序列比对发现，不同物种TMEM39A基因同源性为90% ～97%，针对不同物种TMEM39A基因的保守区域设计荧光定量引物，可以提高种属通用性。

表2 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的组内、组间重复性实验Table 2 Inter-assay and intra-assay reproducibility of SYBR GreenⅠreal-time PCR

图5 不同种属细胞的TMEM39A荧光定量PCR检测Fig．5 Different species of cells detection by the established TMEM39A real-time PCR assay

本实验成功建立了TMEM39A基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。此方法经过条件优化后，特异性较好，仅TMEM39A-Standard能够出现特异性扩增，跨膜蛋白39B基因(TMEM39B)、跨膜蛋白43基因(TMEM43)及干扰素诱导的跨膜蛋白2基因(IFITM2)的阳性克隆载体均不产生扩增;灵敏性可达3.937×102拷贝·μL－1，是常规 PCR方法灵敏度的100倍左右;组内和组间变异系数均小于1%，具有较高的重复性和稳定性;可以检测不同种属来源细胞中的TMEM39A基因含量，具有种属通用性。但不同种属来源细胞中TMEM39A基因的表达水平不同，其中，肿瘤细胞(A431、HuH-7及 HeLa)中TMEM39A基因均呈高水平表达。有研究表明，TMEM39可能参与Parkin介导的线粒体自噬［12］，线粒体自噬和线粒体被认为是肿瘤发生和发展的重要调控因子［13－15］。鉴于 TMEM39A 与肿瘤细胞的相关性，自噬可能成为TMEM39A进一步研究的方向［16］。该方法的建立为临床提供了一种TMEM39A的快速检测和定量分析技术，并为进一步研究TMEM39A功能奠定了基础。