HPLC测定天麻配方颗粒中天麻素和对羟基苯甲醇的含量

相继芬，邓辰辰，刘圆，韩蕾，徐桂红，萧伟*

(1.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001；2.中药提取精制新技术重点研究室，江苏 连云港 222001)

天麻具有息风止痉、平抑肝阳等功能，用于小儿惊风、癲痫抽搐等[1]，是中国的传统中药，名贵药材[2]。中药配方颗粒为单味中药经现代化提取等过程制成的新型颗粒剂[3]，是中药饮片的补充形式，既满足了中医临床辨证论治、随证加减的临床用药特点[4-5]，又有利于现代智能化药房的标准化。天麻配方颗粒是天麻饮片经水提取、浓缩、干燥、制粒等工序制成的单方颗粒剂。天麻素和天麻苷元即对羟基苯甲醇为天麻中主要的药用活性成分[6]，天麻素具有镇静、镇痛、安眠等作用[7]，对羟基苯甲醇与天麻素一样具有镇痛效果[8]。本文采用高效液相色谱法对天麻配方颗粒中天麻素和对羟基苯甲醇的含量进行研究，为制定其质量标准提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；Millipore超纯水纯化系统(美国密理博公司)；KQ-250DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BP211D型电子分析天平(德国Sartorius)；ME104E电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 试药

天麻配方颗粒(江苏康缘药业股份有限公司，批号：CP161101)；天麻素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110807-201608，纯度97.6%)；对羟基苯甲醇(中国食品药品检定研究院，批号：111970-201507，纯度98.5%)；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welch Ultimate LP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸(4∶96)；柱温：30 ℃；检测波长：220 nm；流速：0.8 mL·min-1。

2.2 对照品溶液的制备

取天麻素对照品、对羟基苯甲醇对照品适量，精密称定，加流动相制成每1 mL含天麻素230 μg、对羟基苯甲醇50 μg的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取天麻配方颗粒适量，研细，称取0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取乙腈-水(4∶96)50 mL加入，称定重量，超声提取30 min，放冷至室温，再称定重量，用乙腈-水(4∶96)补足减失的重量，取续滤液，即得。

3 方法学验证

3.1 阴性验证

阴性溶液的制备：天麻配方颗粒在制剂过程中加入一定量的辅料糊精，为考察辅料是否有干扰，按处方比例称取适量辅料制成阴性样品，并按2.3项下方法制备阴性样品溶液，分别精密吸取对照品溶液、阴性供试品溶液、供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，见图1。

注：A.对照品；B.阴性供试品；C.供试品；1.天麻素；2.对羟基苯甲醇。图1 对照品、阴性供试品、供试品HPLC对比图谱

结果表明，阴性供试品溶液对天麻素和对羟基苯甲醇测定无干扰。

3.2 线性关系考察

3.2.1 天麻素 精密称取天麻素对照品适量，制得一定浓度的对照品溶液(质量浓度为0.986 2 mg·mL-1)。分别取对照品溶液0.5、1、2、3、5、10 mL分置于6个容量瓶中，加乙腈-水(4∶96)定容至10 mL，即得质量溶度为49.31、98.62、197.24、295.86、493.1、986.2 μg·mL-1的溶液，分别进样5 μL，以进样浓度为横坐标(X)，天麻素峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线。结果表明，天麻素在49.31～986.2 μg·mL-1呈良好线性关系，线性回归方程：Y=205.39X-0.072 5，r=0.999 6。

3.2.2 对羟基苯甲醇 精密称取对羟基苯甲醇对照品适量，制得一定浓度的对照品溶液(质量浓度为0.758 9 mg·mL-1)。分别取对照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、1.5、2.0 mL分置于6个容量瓶中，加乙腈-水(4∶96)定容至10 mL，即得质量溶度分别为7.589、30.356、60.712、91.068、113.835、151.78 μg·mL-1的溶液，分别进样5 μL，以进样浓度为横坐标(X)，对羟基苯甲醇峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线。结果表明，对羟基苯甲醇在7.589～151.78 μg·mL-1呈良好线性关系，线性回归方程：Y=390.42X-0.263 2，r=0.999 6。

3.3 精密度试验

精密吸取天麻素和对羟基苯甲醇混合对照品溶液重复进样6次，计算其峰面积，天麻素RSD为0.02%，对羟基苯甲醇RSD为0.08%，结果表明仪器精密度良好。

3.4 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，记录峰面积。天麻素RSD为0.27%，对羟基苯甲醇RSD为0.38%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.5 重复性试验

取同一批天麻配方颗粒样品(批号：CP161101)，按制备供试品溶液方法制备，平行制备6份，测定其天麻素质量分数分别为22.506、22.534、22.500、22.500、22.498、22.531 mg·g-1，6个测定结果的RSD为0.07%，对羟基苯甲醇含量结果分别为2.655、2.655、2.674、2.651、2.651、2.650 mg·g-1，计算6个测定结果的RSD为0.34%，表明该方法重复性良好。

3.6 加样回收率试验

采用加样回收法[9]，取已知含量的样品(批号：CP161101，天麻素质量分数为22.51 mg·g-1，对羟基苯甲醇质量分数为2.65 mg·g-1)约0.25 g，精密称定，平行称取6份，置锥形瓶中，各组分别精密加入天麻素对照品溶液(每1 mL含天麻素10.841 mg)0.5 mL；对羟基苯甲醇对照品溶液(每1 mL含对羟基苯甲醇1.584 mg)0.5 mL，精密加入乙腈-水(4∶96)50 mL，超声提取30 min，放冷，称定重量，用乙腈-水(4∶96)补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取5 μL，注入液相色谱仪，测定，分别计算天麻素和对羟基苯甲醇回收率，结果见表1，结果表明该方法回收率良好。

表1 天麻素和对羟基苯甲醇加样回收率(n=6)

3.7 样品含量测定

取天麻配方颗粒适量，各3份，按照2.3项下制备供试品溶液，分别进样，测定天麻素和对羟基苯甲醇峰面积，计算其含量，结果见表2。

表2 天麻配方颗粒含量测定结果(n=3)

4 讨论

4.1 检测波长的选择

实验采用DAD检测器对天麻素和对羟基苯甲醇对照品混合溶液进行全波长扫描，并对检测波长进行了选择。实验表明，天麻素在220.77 nm处吸收峰响应值较高，对羟基苯甲醇在223.40 nm处吸收峰响应值较高，其他色谱峰均不干扰测定，并通过参考文献[10]及《中华人民共和国药典》2015年版，最终确定220 nm作为天麻素和对羟基苯甲醇共同检测波长。

4.2 流动相条件的确定

实验分别采用不同条件(甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液)为流动相进行研究考察，结果表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液为系统条件下天麻素和对羟基苯甲醇均能达到基线分离，对称性良好，故最终确定乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相。

4.3 提取条件的确定

考察不同提取溶剂[50%甲醇、50%乙醇、乙腈-水(4∶96)]、不同的提取方法(回流、超声)和不同提取时间(15、30、45 min)等因素对提取结果的影响。最终确定提取方案：以乙腈-水(4∶96)为提取溶剂，超声提取30 min。

4.4 色谱条件耐用性考察

本文通过对不同品牌高效液相色谱仪、不同品牌色谱柱、不同流速、不同柱温进行考察，结果表明本文采用的色谱条件耐用性良好。