人参病害生防细菌分离 鉴定及其抑菌活性测定△

张晓云，丁万隆，王蓉，李勇

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

人参PanaxginsengC.A.Meyer为五加科人参属药用植物，我国传统名贵中药材，主产于我国东北地区。根据《中华人民共和国药典》(2010版)[1]记载，人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智等功效。近年，由于人参被列入药食同源名录，市场多元化导致人参需求量逐年增加，人参种植规模也是逐年攀升，这为人参致病菌繁衍和传播创造了有利条件，病害问题愈发凸显，对人参产量及品质威胁较大[2]。

目前，防治人参病害主要依赖化学农药，不合理用药常导致农药残留超标、生态环境污染以及病菌抗药性等[3]问题。研究发现，木霉菌、芽孢杆菌、假单胞菌等[3]通过营养竞争、空间竞争、重寄生、合成抗生素等途径，实现对植物病害的控制ADDINEN.CITE.DATA[4-5]。另外，生防菌合成的次生代谢物还具有植物促生长作用。实践证明，生物防治是化学防控的有效替代方案之一。目前，市场上商品化微生物菌剂种类繁多、质量参差不齐，是否对人参等中药材病害有理想防效尚需验证。鉴于人参病害田间防效评价受季节限制，周期长、成本高、评价结果易受环境因子影响，本研究直接从商品菌剂中分离菌株，通过对峙培养方法快速验证菌株的抑菌活性，间接评价菌剂的生防潜力，为人参病害绿色防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

人参锈腐菌Cylindrocarpondestructans、人参菌核菌Sclerotiniaschinseng、人参黑斑菌Alternariapanax、人参根腐菌Fusariumoxysporum、人参疫病菌Phytophthoracactorum(Leb.et Coh.)Schroet、人参灰霉菌BotrytiscinereaPers.、人参立枯丝核菌RhizoctoniasolaniKuhn，由课题组保存。

1.2 供试菌剂

“KDL”复合微生物菌剂；“QM”微生物菌剂1号；“GGB”微生物菌剂。

1.3 分离纯化

用无菌蒸馏水将微生物菌剂梯度稀释成质量浓度为1×104、1×103、1×102、10 mg·L-1的菌悬液，分别取100 μL，均匀涂布于LB培养基表面，37 ℃恒温倒置培养24 h。观察菌落生长情况，挑取不同颜色、形态的单菌落划线培养，纯化后-80 ℃保存、备用。

1.4 抑菌活性筛选

采用对峙培养法。PDA平板中心画十字线，在十字线距离边缘1 cm处接种待测菌株，中心接种人参致病菌。25 ℃恒温黑暗倒置培养。只在PDA培养基中心接种人参致病菌作为空白对照。每个处理3次重复。对峙培养5 d～7 d后，测量病菌菌落半径和抑菌带宽。

(1)

1.5 生防细菌的鉴定

1.5.1 显微形态观察 取待测菌液5 mL，5000 r·min-1离心3 min，弃上清。PBS重悬细胞，离心，重悬于1 mL 2.5%的戊二醛中，4 ℃放置过夜，离心弃上清。用1 mL PBS缓冲液洗涤细胞沉淀3次，离心前室温震荡15 min，弃上清。再分别用1 mL 50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇洗涤细胞沉淀，离心前室温放置10 min。用1 mL叔丁醇洗涤细胞3次，静置过夜，将细胞均匀涂于盖玻片上，真空冷冻干燥，喷金观察。

1.5.2 基因序列分析 引物gyrA-f(5′-CAG TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT-3′)和gyrA-r(5′-CAA GGT AAT GCT CCA GGC ATT GCT-3′)用于细菌gyrA基因扩增[6]。PCR反应体系50 μL，包括：10×PCR Buffer(100 mmol·L-1Tris，500 mmol·L-1KCl，20 mmol·L-1Mg2+，pH8.3)5 μL，Taq DNA聚合酶(2.5 U·μL-1)0.25 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)4 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各2 μL，模板DNA(菌悬液)4 μL，ddH2O补足剩余体积。PCR程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。简并引物UP-1S(5′-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCN GGN GGN AAR TTY GA-3′)和UP-2Sr(5′-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CCR TCN ACR TCN GCR TCN GTA T-3′)用于细菌gyrB基因扩增[7]。PCR反应体系25 μL，包括：10×Ex Taq Buffer(含Mg2+)2.5 μL，TaKaRa Ex Taq(5 U·μL-1)0.25 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)1 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各2 μL，模板DNA(菌悬液)1 μL，ddH2O补充剩余体积。PCR程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，34个循环；72 ℃延伸10 min。

基因扩增产物用DNA纯化试剂盒(TIANGEN)回收，回收条带连接T-vector PMD 19载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。菌落PCR检验有目的基因插入的阳性转化子，用质粒小提试剂盒(TIANGEN)提取质粒，交由北京擎科新业生物技术有限公司测序，序列与GenBank数据库进行BLAST比对分析。

1.6 数据分析

Excel 2007用于菌株抑菌活性分析及图表绘制；SPSS 20.0软件用于显著性方差分析。

2 结果与分析

2.1 菌株培养性状和形态特征

最终从“KDL”复合微生物菌剂分离到12株细菌(编号Y1～Y12)，“QM”微生物菌剂1号和“GGB”微生物菌剂未分离到活体菌株。分离菌株在LB培养基上呈圆形、不光滑、不透明、边缘不规则锯齿状、表面有大量皱褶，乳白色至微黄色，无可溶性色素。扫描电镜观察发现，菌株均呈短棒状或杆状，单生，两端钝圆，(1.278～3.302)μm×(0.515～1.171)μm。

2.2 菌株抑菌活性

对峙培养结果表明，菌株Y1～Y11对七种人参致病菌均有抑菌活性(表1)，菌株Y12无抑菌活性。其中，Y2对人参疫病菌、人参黑斑菌、人参灰霉菌和人参锈腐菌的抑菌率最高(分别为68.25%±1.81%、52.58%±1.68%、49.46%±2.25%和40.65%±3.26%)；Y4对人参菌核菌的抑菌率最高(68.42%±3.04%)；Y9对人参立枯病菌的抑菌率最高(54.07%±3.39%)；Y3对人参根腐菌的抑菌率最高(47.37%±3.95%)。

表1 生防菌株对人参致病菌的抑菌率±s，n=3)

注：表中同列数据不含相同字母表示存在显著差异(P<0.05)。

图1 分离菌株对人参致病菌的抑菌活性

由图1可见，分离菌株对人参疫病菌的抑菌能力最强，其中Y9抑菌带宽24.0 mm，Y2次之，Y1抑菌带最窄(20.0 mm)。除人参疫病菌外，分离菌株对人参黑斑菌、人参灰霉菌和人参菌核菌的抑菌能力也较强，其中Y2对人参黑斑菌、人参灰霉菌的抑菌带宽分别为15.83 mm和12.33 mm，Y5对人参菌核菌的抑菌带宽达15.5 mm。上述菌株对人参锈腐菌、人参根腐菌和人参立枯丝核菌的抑菌能力相对较弱，抑菌带宽仅5.83～11.75 mm。

2.3 菌株鉴定

经PCR扩增，得到长度为977 bp的gyrA基因片段。序列比对发现，菌株Y1与枯草芽孢杆菌B.subtilis(CP016894，KX281184)同源性最高(100%)；菌株Y8与枯草芽孢杆菌B.subtilis(CP022391，CP021985)同源性最高(99%)。其他菌株仅鉴定到芽孢杆菌属Bacillusspp.。经PCR扩增，得到长度为686 bp～711 bp的gyrB基因片段。经序列比对，菌株Y2与枯草芽孢杆菌B.subtilis(CP018173.1)序列同源性最高(100%)；菌株Y3～Y7、Y9～Y11与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens(KF421826)同源性最高(100%)。

综合菌株形态学特征以及gyrA、gyrB基因序列比对结果，鉴定Y1、Y2、Y8为枯草芽孢杆菌B.subtilis；Y3～Y7、Y9～Y11为解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens。

3 讨论

病害问题一直是困扰人参产业健康发展的主要因素之一。针对人参病虫害问题，目前主要通过农业措施[8]、化学防治[9-10]等手段加以预防和控制，但实际生产中暴露出严重的农残超标、生态环境污染以及潜在的病菌和害虫害抗药性等问题。充分利用自然界天敌生物，通过生物防治手段解决中药材病虫害问题，是实现中药材产业健康发展的关键[11]。芽孢杆菌是农作物病害防治中应用较为广泛的一类生防菌，其能在植物根际快速定殖，并通过生态位点竞争、诱导植物抗病性、合成抗生素、植物促生长等途径减轻病害的发生与为害ADDINEN.CITE.DATA[12-13]。本研究对三种商品微生物菌剂进行考察，发现仅有一种能够分离出活体菌株，且大部分菌株均对人参致病菌有较为理想的抑菌活性，说明市售微生物菌剂质量参差不齐，盲目选用可能会带来较大病害防控风险。根据已有研究报道，前人已从人参内生菌及人参根际土壤中分离到对人参致病菌有较好抑制作用的菌株，本研究分离的生防细菌对人参疫病菌、人参菌核菌和人参黑斑菌的抑菌活性略高于先前报道的生防菌株ADDINEN.CITE.DATA[14-16]，但对其余四种人参致病菌的抑菌活性较已报道的生防细菌ADDINEN.CITE.DATA[15-17]、生防真菌ADDINEN.CITE.DATA[18-19]及放线菌ADDINEN.CITE.DATA[20-22]略低。考虑到该菌剂产品对全部供试人参致病菌均有抑菌活性，且对部分人参致病菌的抑菌活性较高，说明该产品具有较好的病害生防潜力，可尝试用于人参病害的田间防治。

与真菌不同，仅依靠菌落形态和培养性状往往很难鉴定细菌的归属。根据以往研究，细菌鉴定常常需要参考生理生化指标特征以及特定基因序列[23]。16S rDNA是细菌鉴定最常用到的基因区段，但是仅靠该区段核酸序列往往难以区分亲缘关系较近的菌株[24]。本研究也发现，仅通过16 S rDNA基因序列无法区分解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌。根据已有报道，细菌蛋白编码基因(如rpoB、gyrA、gyrB、cheA、phoR等)较16 S rDNA具有更高的基因进化速率，其可能在近缘物种鉴定时发挥重要作用ADDINEN.CITE.DATA[25，26]。为此，本研究又扩增了DNA促旋酶A蛋白编码基因gyrA和gyrB，成功将枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌准确区分。上述结果表明，gyrA、gyrB基因在细菌近缘种的鉴别上具有较16 S rDNA基因更高的分辨能力。