橡胶树ADC1的克隆、表达及生物信息学分析

2018-11-30侯岚菲杨洪邓治代龙军门中华李德军

生物技术通报 2018年11期

侯岚菲杨洪邓治代龙军门中华李德军

（1. 包头师范学院生物科学与技术学院，包头 014030；2. 中国热带农业科学院橡胶研究所/农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室/海南省热带作物栽培生理学重点实验室，儋州 571737）

橡胶树（Hevea brasiliensis）原产于亚马逊河流域，是2 000多种产胶植物中唯一商业化种植收获胶乳（天然橡胶原料）的植物。天然橡胶作为四大工业原料之一，是关系国计民生的基础产业和重要战略物资。我国天然橡胶供需矛盾日益凸显，自2009年以来自给率已不足20%。我国属非传统植胶区，橡胶树在生长周期内不可避免会受低温、台风、季节性干旱、病虫害等逆境条件影响。作为橡胶树生长环境中的重要影响因子，逆境胁迫必然对橡胶树的生长、发育和胶乳代谢等造成影响［1-4］。因此，如何有效提高橡胶树对逆境胁迫的耐受性，是橡胶树研究领域中重要且有潜在应用前景的课题。

多胺（Polyamines，PAs）是一类具有强生物活性的低分子脂肪族含氮碱，它可调节植物胚胎发生、根茎生长和衰老、花发育和果实成熟等生理过程［5-8］。PAs生物合成起始于腐胺（Putrescine，Put），在由精氨酸脱羧酶（Arginine decarboxylase，ADC）和鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase，ODC）催化的2条Put合成途径中［9］，已报道的多数植物中以ADC合成途径为主。ADC是一种依赖于吡哆醛-5'-磷酸（Pyridoxal 5'-phosphate，PLP）的酶［10］，作为PAs合成的重要酶，ADC在调控PAs动态平衡中发挥重要作用，同时ADC还与植物的抗逆相关。继燕麦中克隆ADC基因后［11］，又相继从苹果、水稻、桃、棉花、颠茄等物种中克隆和鉴定出［12-16］。ADC基因表达一般无组织特异性，它通过调节PAs代谢参与植物抗逆反应。酸胁迫下大豆ADC活性增加，并与ADCmRNA水平呈正相关［17］。在水稻中过表达曼陀罗ADC基因可提高Spd和Spm水平，进而增强水稻抗旱性［18］。在金柑中，转录因子FcWRKY70通过调控ADC基因表达水平来调节Put合成，以此增强植株抗旱性［19］，ADC基因的表达调控PAs的水平，增强杜梨抗旱性［20］。胁迫诱导的AtADC2调节植株体内Put积累，从而增强转基因拟南芥的抗旱和耐盐性，AtADC2突变体对盐敏感需外施Put缓解［21-22］。ADC与枳ICE1相互作用调节PAs水平增强抗寒能力［23］。提高小麦中依赖ADC的Put含量从而降低根细胞壁的铝残留率，增强小麦植株的耐铝性［24］。除与非生物逆境反应相关外，ADC基因还参与细胞凋亡、抗病和防御反应。胡椒ADC1通过调节PAs和γ-氨基丁酸代谢调控细胞凋亡和防御反应［25］。拟南芥ADC基因参与植株对抗黄绿假单胞菌的反应［26］。柑橘中过表达枳PtADC导致转基因植株矮化，气孔密度降低，并极显著地提高了植株对溃疡病的抗性［27］。

鉴于PAs代谢重要基因—ADC在进化和功能上的保守性，推测其可能在橡胶树逆境胁迫耐受性中发挥重要作用。本实验克隆了一个橡胶树ADC基因、研究了其表达模式，为深入解析该基因在橡胶树中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

所用橡胶树的组织样品（雄花、雌花、茎尖、树皮、胶乳和叶片）、不同发育时期叶片、过氧化氢（H2O2）、伤害及乙烯利（Ethephon，ET）处理的胶乳样品，均采自中国热带农业科学院试验农场定植的橡胶树品系热研7-33-97。低温、干旱、高盐胁迫处理取材为移栽6个月且长势基本一致的热研7-33-97组培苗叶片。

1.2 方法

1.2.1 材料处理选取长势基本一致的未开割热研7-33-97进行创伤、H2O2、ET处理，以不作任何处理的未开割树为对照。每个处理时间点取3次重复，每次重复取样5棵树，采集的胶乳在液氮中速冻并保存，用于后续RNA提取。参考Hao等［28］方法，用1%的ET涂于割线及其上方约2 cm割面处，并采集处理0、4、8、24、48及72 h后的胶乳。伤害和H2O2处理参考Zhu等［29］和 Tang等［30］的方法，将2% H2O2浸泡的棉花包在割线及其上方约2 cm割面处，采集处理0、6、24及48 h后的胶乳，用于提取RNA。对橡胶树品系热研7-33-97组培苗进行低温、干旱、高盐胁迫处理，洗净组培苗根部泥土并放入清水中，在温度为30℃、湿度为80%、光照12 h（光照强度 480 μmol·m-2·s-2）及黑暗 12 h环境中静置培养2-3 d，随后进行胁迫处理。参考安泽伟等［31］方法进行低温（4℃）处理，参考刘辉等［32］方法进行干旱及高盐胁迫处理，干旱和高盐胁迫条件分别用30% PEG 6000及1 mol/L NaCl，采集处理0、3、24及48 h后的叶片并立刻用液氮冻存提取RNA。

1.2.2 总RNA提取、cDNA合成和基因克隆样品总RNA提取用北京百泰克生物技术有限公司的通用植物总RNA提取试剂盒，提取方法参照说明书。用分光光度法进行定量检测，用琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测。样品cDNA合成操作参照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明。

根据橡胶树割面干涸机制实验室获得的部分橡胶树ADC基因序列设计特异性引物（F：5'-GCATA G A A C A A A G G C A C C A A T T G-3'和R：5'-GCATAGA-ACAAAGGCACCAATTG-3'）扩增橡胶树ADC基因，并通过测序获得基因序列。

1.2.3 生物信息学分析开放阅读框预测用NCBI的ORF fi nder；蛋白保守结构域预测用NCBI保守结构域数据库网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）；用 Smart分析蛋白保守结构域（http://smart.emblheidelberg.de/）；用Expasy网站的Prot-Param程序分析蛋白质理化性质（http://web.expasy.org/protparam/）；同源性分析用NCBI中的BLAST和DNASTAR软件；信号肽预测用SignalP 4.1 Server软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；用TMHMM 2.0程序预测跨膜结构域（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；通过在线工具Psort分析目的序列的亚细胞定位（https://www.genscript.com/psort.html）。用 ClustalX 1.8及MEGA 5.1做多序列比对并构建进化树［33］。

1.2.4 实时荧光定量PCR 根据HbADC1序列设计特异性荧光定量引物（F：5'-GGTTTATACTATGGCAACGAG-3' 和 R：5'-GCACAAAACCAACCATACACG-3'），以不同样品反转录cDNA稀释5倍后作为模板，反应体系为模板2 μL、正反向引物各1 μL、SYBR Premix Ex Taq II（2×）10 μL 及 ddH2O 6 μL。内参为橡胶树18S rRNA（F：5'-GCTCGAAGAC G A T C A G A T A C C-3'和 R：5'-TTCAGCCTTGCGACC-ATAC-3'）。每个样品设置3个生物学重复，基因相对表达量用2-ΔΔCt法计算。用Origin 9.0软件进行数据处理并作图，相对表达量结果为3次重复的x-±s。

2 结果

2.1 HbADC1的克隆及序列分析

在分析橡胶树转录组测序数据时发现一条与植物ADC基因高度一致的序列（TSA接受号：GDFU01108758）。根据该序列设计特异性引物，以橡胶树cDNA为模板进行PCR。扩增产物切胶回收并连接到pMD18-T载体，挑选阳性克隆PCR扩增验证后进行测序。测序结果（图1）表明，该序列长2 594 bp且包含完整ORF，经Blastx比对，确定该基因为植物ADC家族成员，并命名为HbADC1。HbA-DC1最长开放阅读框2 175 bp，编码724个氨基酸。

2.2 HbADC1的生物信息学分析

HbADC1预测理论分子量约为77.7 kD，理论等电点为5.14。HbADC1第119-687位为ADC保守结构域，第130-404位和第436-604位残基分别为鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸和相关底物的结合位点，属于2-磷酸吡哆醛依赖性的Ⅳ型（鸟氨酸/二氨基庚二酸/精氨酸）ADC家族［37］。信号肽预测结果（图2）显示，HbADC1无信号肽。亚细胞定位预测结果表明该蛋白属叶绿体运输肽、线粒体靶肽和分泌途径信号肽外的其他类蛋白。

为分析HbADC1与其他植物ADC蛋白的进化关系，通过ClustalX 1.8和MEGA 5.1软件，用N-J（neighbor-joining）法进行1 000次Bootstrap构建橡胶树（Hevea brasiliensis）、木薯（Manihot esculenta）、麻风树（Jatropha curcas）、蓖麻（Ricinus communis）、毛白杨（Populus trichocarpa）、苹果（Malus domestica）、枣树（Zizyphus jujuba）、烟草（Nicotiana tabacum）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、可可（Erythroxylum coca）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、乌拉尔图小麦（Triticum urartu）ADC蛋白系统进化树。结果（图3）表明，HbADC1与木薯 ADC（XP_021610770.1）、麻风树ADC（XP_012084432.1）蛋白为一个分支，与玉米、水稻和小麦等ADC蛋白属不同分支，暗示HbADC1与木薯和麻风树ADC蛋白亲缘关系较近，而与玉米、水稻和小麦等ADC蛋白亲缘关系较远。

2.3 HbADC1的表达分析

图1 HbADC1核苷酸序列及推导的氨基酸序列

图2 HbADC1同源蛋白序列比对

以橡胶树18S rRNA作为内参，对不同组织、不同发育时期叶片、逆境胁迫和乙烯处理条件下的HbADC1表达模式进行实时荧光定量PCR分析。

2.3.1HbADC1在不同组织及叶片不同发育时期的表达分析实时荧光定量PCR结果（图4）表明，HbADC1在橡胶树不同组织（叶片、雌花、雄花、树皮、胶乳、茎尖）中均有表达，雌花中表达最高，接下来是茎尖、雌花、叶片、树皮和胶乳。

HbADC1在叶片不同发育时期表达存在差异，淡绿期表达量远高于其他4个时期，古铜期、变色期和衰老期表达量相当，稳定期表达量最低（图5）。

2.3.2HbADC1在不同逆境处理条件下的表达分析与其他植物ADC基因在逆境条件下表达模式一致，低温、干旱、伤害、高盐及H2O2处理均能调控HbADC1表达，各处理HbADC1表达模式各异。

低温胁迫下，HbADC1表达呈现先微降后显著上升模式（图6-A）。干旱处理后，HbADC1表达水整体呈升高趋势，24 h持续上调并在48 h保持平稳（图6-B）。伤害处理，HbADC1表达先上升，后下降再上升，处理后24 h和48 h表达水平均低于处理前水平（图6-C）。HbADC1的表达受高盐胁迫调控，HbADC1表达在高盐胁迫后先下降，随后上升并在24 h达到最高后又下降（图6-D）。HbADC1的表达还受H2O2诱导，处理后的表达水平先升后降，表达最高和最低点分别出现在6和48 h（图6-E）。综合HbADC1在逆境条件下表达模式，推测HbADC1参与橡胶树多种逆境胁迫反应，并在其中发挥重要作用。

图3 HbADC1与其他植物ADC蛋白的系统进化分析

图4 不同组织中HbADC1的表达

图5 叶片不同发育时期HbADC1的表达

2.3.3HbADC1在乙烯处理下的表达分析 ET是橡胶树中研究最深入且应用最广的植物激素，作为橡胶树增产刺激剂，ET通过延长排胶时间提高橡胶树胶乳产量。实时荧光定量PCR结果（图7）显示HbADC1表达受ET调控。ET处理后HbADC1表达存在波动，呈先升后降再升模式，但整体呈上升趋势，处理后各时间点表达量均高于处理前，8 h达到表达高峰，上述结果暗示HbADC1参与橡胶树ET反应。

图6 不同胁迫下HbADC1的表达

图7 ET处理下HbADC1的表达

3 讨论

ADC是PAs合成途径中一种依赖于PLP的重要酶。本研究克隆了一个橡胶树的ADC基因，HbADC1序列长2 594 bp，最长ORF序列长2 175 bp，编码724个氨基酸。与其他植物ADC蛋白一致，HbADC1包含ADC保守结构域，具有鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸和相关底物的结合位点，属于2-磷酸吡哆醛依赖性的Ⅳ型ADC家族［34］，与已鉴定的植物ADC蛋白相同［12，22］。以上结构域和特征对ADC蛋白行使功能至关重要，推测HbADC1具有ADC蛋白活性，可行使ADC蛋白功能。拟南芥AtADC1和AtADC2在细胞质和叶绿体中均表现出双重亚细胞定位［35］，与此不同，亚细胞定位预测HbADC1不定位于叶绿体，属其他类蛋白。当然，HbADC1亚细胞定位预测结果还有待于进一步实验确认。橡胶树属大戟科，进化分析显示HbADC1与大戟科植物木薯、麻风树等ADC蛋白为同一分支，与玉米、小麦和水稻等ADC蛋白属不同分支，表明其与大戟科植物木薯、麻风树等ADC蛋白亲缘关系较近。上述结果与传统分类一致，暗示HbADC1与上述植物ADC蛋白功能相似。

本研究发现HbADC1表达无组织特异性，该结果与其他植物ADC基因组织表达模式相似，如桃树ADC基因在根和老叶中表达量最低，在嫩枝和幼叶中的表达高于花和茎［14］；棉花ADC基因在叶片的表达量远高于根和茎，在根中表达量最低［16］；芥菜ADC基因主要在根和茎中表达，在叶片中几乎不表达［36］；AtADC1为组成型表达，而AtADC2仅在莲座叶和角果中表达［37］。此外，HbADC1在橡胶树叶片淡绿期表达远高于其他4个时期，暗示HbADC1与橡胶树叶片发育密切相关。

植物ADC活性调节依赖于生理条件，且与多种非生物胁迫有关［18-21，23-25，27］。拟南芥中 ADC 活性低会减少PAs合成，从而降低植株耐盐性［38］。PbrMYB21在烟草中过表达使ADC表达上升，PAs积累增强了烟草对脱水和干旱胁迫的耐受性［20］；拟南芥和芥菜中ADC活性分别受渗透胁迫和盐胁迫调控［36，39］；AtADC2在细菌侵染后表达上升，蛋白活性增加［26］。与上述结果相似，本研究中HbADC1表达受干旱、低温、伤害、高盐和H2O2等逆境胁迫调控，表明HbADC1可能参与巴西橡胶树逆境胁迫反应。ET通过延长排胶时间提高胶乳产量［40］。本研究发现，ET处理后HbADC1表达存在波动，但整体呈上升趋势，暗示其可能参与橡胶树ET反应和产排胶过程。