贵州主栽樱桃品种的花粉量及其低温保存效果

仇志浪，郭凯斌，文 壮，邓 彬，李正春，文晓鹏

(贵州大学 农业生物工程研究院/生命科学学院，山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

【研究意义】樱桃(Cerasuspseudocerasus)属蔷薇科(Rosaceae)，李亚科(Prunoideae)，樱属(Cerasus)果树，因其外观鲜艳、味道鲜美，富含多种维生素，营养丰富，且成熟时间较早，有“早春第一果”的美誉[1]，深受人们喜爱，种植的经济效益显著。根据联合国粮食和农业组织(FAO)数据显示，2012年全球有记录的樱桃种植面积达401 656 hm2，比2010年增加4.2 %，世界各国樱桃种植面积所占比例发生变化[2]。全球樱桃种植面积广，需求量大，尤其是中国大陆，需大量进口，供不应求。据统计，中国的樱桃2016年产量激增约30 % (7.0万t)，达32.0万t。进口方面，2016 年中国大陆进口樱桃总量稍有增加，达9.5万t，香港进口8.0万t，台湾进口1.0万t，总进口量达18.5 万t，占世界樱桃贸易的44.9 %[3]。因此，对樱桃研究的进一步加深，使其产量提高，对减少进口、增加经济收入具有重要意义。【前人研究进展】花粉萌发率的高低会影响花粉授精，进而影响坐果，故樱桃的产量与花粉萌发率密切相关。低温和干燥的环境下，代谢过程减弱且呼吸作用降低，能较长时间保持花粉活力。随贮藏时间的延长，花粉贮藏物质消耗过多，酶活性下降，水分过度缺乏，从而使活力下降[4]。低温保存可适当延长花粉寿命，但活力仍会下降，超低温可长时间保持花粉活力[5]。目前已在扁桃[6]、猕猴桃[7]、澳洲坚果[8]、杨梅[9]、梨[10]、桃[11]等多种果树中已经成功实现超低温保存花粉。但在樱桃上研究较少，且只设置了3种温度[液氮(-196 ℃)、-80 ℃及-20 ℃]进行保存，不具有代表性[12]。【本研究切入点】樱桃大多自交不亲和[13]，花期易遭受不良气候影响，导致落花落果现象严重，配制授粉树、花期放蜂等方法可增加授粉机会；但因某些品种间花期不相遇，需对花粉进行保存来完成人工授粉。按照保存时间的长短，花粉保存方法可分为：短期保存(当年)和长期保存(次年)，但不同果树花粉的保存方式存在一定差异，如扁桃与猕猴桃所需最好保存温度就存在差异[6-7]。而樱桃花粉保存方法比较的研究较少。【拟解决的关键问题】因此，为找出较适保存方法，笔者等以贵州主栽樱桃品种为试验材料，比较各品种的花粉量，并以中国樱桃“黑珍珠”为材料，从干燥时间、保存方法、预冻及解冻方式等方面筛选适合樱桃花粉保存的最优方法，旨在为樱桃的人工授粉及杂交育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以贵州主栽的中国樱桃“黑珍珠”、“玛瑙红”和甜樱桃“黑珍珠”、“斯帕克里”、“桑提娜”“布鲁克斯”为材料，测定各樱桃的花粉量和花药量。

以中国樱桃品种“黑珍珠”大花蕾期的花朵为材料，测定不同预冻和解冻方式、不同干燥时间、不同保存方法条件下的花粉萌发率。

以中国樱桃品种“黑珍珠”小花蕾期(A)、大花蕾期(B)、全开放期(C)的花朵为材料，测定不同发育时期的萌发率。

小花蕾期材料：直径4～6 mm，花朵紧实；大花蕾期材料：直径7～9 mm，花朵膨胀充分，即将展开的；全开放期材料：直径18～25 mm，花朵充分开放。

1.2 试验方法

1.2.1 花药量和花粉量的测定 花药量的统计：随机从同一植株挑选5个大花蕾期的花朵，以每个花蕾的花药为单位，统计单花花药量，3次重复，共3个植株，15个花蕾。

花粉量的统计采用纤维素酶法：分别取10粒完整的花药放入1.5 mL离心管中，于25 ℃温箱烘干，使其散粉，然后加入2 %的纤维素酶1 mL水解24 h，使粘连在花药壁上的花粉粒游离下来。用涡旋振荡器充分震荡混匀后，取5 μl溶液于载玻片上，将载玻片置于显微镜下统计其花粉数量，3次重复。计算公式如下[14]：单花药花粉量 (粒/花药) = (每个载玻片上总花粉粒数 × 200) /10。

1.2.2 花粉萌发率的测定 花粉萌发率的测定采用离体培养法，培养基配方为：MS培养基+10 %蔗糖+0.5 % 琼脂糖+0.1g/L的硼酸[15]。方法：将培养基滴于凹槽载玻片上，待其凝固之后，用解剖针将花粉撒在培养基上[16]，放于垫有湿润滤纸的培养皿内并盖上，置于25 ℃温箱中培养6 h后在显微镜下统计花粉萌发率。花粉管长度大于花粉粒直径则记为萌发，否则记为未萌发。每处理 3 次重复，每个重复随机选择3个视野观察，每个视野统计花粉数不少于100个。花粉萌发率的计算公式[17]：花粉萌发率=萌发花粉管花粉数/观测花粉总数×100 %。

1.2.3 预冻和解冻方式 将花粉分别在25 ℃下干燥0 h (A1)、2 h (A2)和4 h (A3)后，再分别做预冻处理，预冻处理方法[18]：B1，在4 ℃预冻2 h后，投入-80 ℃冰箱保存；B2，液氮速冻5 min后，投入-80 ℃冰箱保存；B3，直接投入-80 ℃冰箱保存。保存1周后将其取出，分别做解冻处理后再测定花粉萌发率，解冻方法：C1，在室温解冻30 min；C2，自来水解冻15 min ；C3，37 ℃温水解冻5 min 。

1.2.4 干燥和保存方法 将花粉取下，分别在25 ℃下干燥0、30、60和180 min后，将每一干燥温度下的花粉平均分成5份，分别将其保存在室温、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、-80 ℃冰箱和-196 ℃液氮条件下，在保存1、2、3、4、8及16周后测定花粉萌发率。

1.3 数据统计分析

用Excel对所有的花粉萌发率进行反正弦转换。用SPSS 22.0软件对花药量和花粉量试验数据进行均值和标准差计算，采用5(贮藏温度)×4(干燥时间)×6(保存时间)及3(含水量)×3(预冻方式)×3(解冻方式)多变量数据模型进行方差分析，旨在探索出最佳预冻方式和解冻方式。对所得数据用Origin9.0作折线图，用PhotoshopCS6软件对花粉照片进行标记和图像处理。

表1 贵州主栽樱桃品种的单花花粉量

注：表中字母为最小显著差异法0.05水平显著性分析。

Note： Letters in the table indicate significant difference at 0.05 level.

2 结果与分析

2.1 不同樱桃品种的花粉量

从表1看出，不同品种单花花药量存在较大差异，其中，中国樱桃“黑珍珠”的花药量最多，为47个/朵，显著高于所有甜樱桃(P<0.05)；其次为中国樱桃品种“玛瑙红”(41个/朵)、甜樱桃“斯帕克里”(39个/朵)、“黑珍珠”和“布鲁克斯”(38个/朵)；“桑提娜”最少(33个/朵)。

不同樱桃品种间花粉量存在较大差异(表1)，其中，甜樱桃“桑提娜”花粉量最多，为3680粒/花药；其次是甜樱桃“黑珍珠”(3233粒/花药)；中国樱桃“黑珍珠”最少，为820粒/花药。中国樱桃的花粉量均极显著低于甜樱桃。甜樱桃中“斯帕克里”的花粉量最少，与其他几个品种间差异达极显著水平(P<0.01)。

从每朵花来看，甜樱桃“黑珍珠”的花粉量最多，为123 905粒/朵，其次是甜樱桃“桑提娜”(121 629粒/朵)，中国樱桃 “玛瑙红”最少(35 473粒/朵)；甜樱桃各品种均高于中国樱桃各品种。中国樱桃两品种间差异不显著(P>0.05)；中国樱桃的花粉量显著低于甜樱桃的花粉量(P<0.05)；在甜樱桃品种中，“黑珍珠”花粉量最高，与另外几个品种间差异达显著水平(P<0.05)。

2.2 花粉萌发率

2.2.1 花蕾发育时期对花粉萌发率的影响 通过测定不同发育时期花蕾花粉量的结果表明，室温保存1周后，大花蕾期花粉萌发率最高，为39.44 %，显著高于小花蕾期花粉(26.20 %)，而全开放期花朵的花粉萌发率最低，仅25.93 %，但与小花蕾期的差异不显著。为保证后续试验的顺利进行，所以选取大花蕾期的花粉进行后续花粉保存方法及花粉预冻、解冻方法筛选。

2.2.2 干燥时间对花粉萌发率的影响 中国樱桃“黑珍珠”干燥处理前花粉萌发率为54.17 %，经25 ℃干燥后花粉萌发率显著降低，且随干燥时间的增加花粉萌发率逐减(表2)。图1所示，1周内不同干燥时间下，随保存温度的变化，花粉萌发率影响较大，1周以后影响变小。25 ℃干燥30 min后保存效果最佳，直到第16周，干燥30 min后保存的花粉萌发率仍最高(11.40 %,表2)。但随贮存时间的延长，干燥时间对花粉萌发率的影响逐渐降低。

2.2.3 保存方法对花粉萌发率的影响 如图1所示，保存方法对花粉萌发率起着重要作用。无论干燥时间长短，花粉保存到第8周时，保存于室温和4 ℃冰箱的花粉萌发率均降为0，但保存于-20、-80、-196 ℃条件下的花粉仍有萌发率。经25 ℃干燥30 min的花粉在前2周都呈下降趋势，在第3周时保存在-196和4 ℃的花粉萌发率有所上升，其中以4 ℃的花粉上升幅度较大。在第4周，-196和4 ℃保存条件下的花粉萌发率又开始下降，但在第4周时这2种保存条件下的花粉萌发率均高于其他3种保存条件下的花粉，而保存在室温条件下的花粉经过4周后，花粉萌发率降到最低。保存在-196 ℃的花粉直到第16周相对其他4种保存条件萌发率仍最高。

2.2.4 花粉含水量、预冻、解冻方式对花粉萌发率的影响 结果表明，解冻方式对花粉萌发率的影响较大，主体间效应在0.05水平差异显著。未经干燥的花粉(A1)直接投入-80 ℃冰箱(B3)并在室温下解冻30 min(C1)后测定花粉萌发率效果最佳，萌发率为17.01 %。但在37 ℃温水解冻的花粉萌发率均为0；在不受37 ℃温水解冻的情况下，与干燥过的花粉相比，未经干燥的花粉萌发率相对较高，但差异不显著(P> 0.05)。

表2 干燥时间对不同保存温度下花粉萌发率的影响

3 讨 论

对自交不亲和的果树(如苹果[19]、杏[20]、梨[21]、樱桃[1]等)配制授粉树、人工授粉、花期放蜂是提高坐果率的常用手段，因此，选择优良品种作为授粉树尤为重要。在花粉活力相当的情况下，花粉量越高，授粉成功率也越高。本研究所选贵州主栽的两中国樱桃品种中，“黑珍珠”的单花花粉量较“玛瑙红”多，但差异不显著；4个甜樱桃品种中，以甜樱桃“黑珍珠”的单花花粉量最多，其次为“桑提娜”，“斯帕克里”最少；中国樱桃品种的单花花粉量显著低于甜樱桃品种，推测该品种间差异可能是由于其自身遗传特性和进化程度不一所导致[13]。

同一植物的花粉不同发育时期其花粉活力不一，这在唐菖蒲[22]、苜蓿[23]、非洲凤仙花[24]植物中均已得到证实。此外，在大多有关花朵不同开放状态或发育时期对花粉活力影响的报道中，大花蕾期或开放初期花粉均表现出较高的萌发率[25-27]。在贵州主栽樱桃品种中，研究结果与前人一致。小花蕾期可能是由于其花粉未完全成熟而导致花粉萌发率低下，而全开放期则可能是由于暴露在外界环境中时间较长，受外界环境影响较大致使其萌发率降低。因此，如需进行人工授粉，大花蕾期花粉为最佳选择。

花粉保存温度、含水量是花粉保存时间长短的重要因素。含水量过高，可能导致花粉内部水结冰致使细胞破坏，但含水量过低则可能是细胞失水，进而会引起细胞失活。在本研究中，从干燥时间对花粉萌发率的影响看，在1周内未经干燥的花粉萌发率普遍最高，保存于-196 ℃萌发率最低，这可能是由于温度过低导致细胞内部水分结晶而破坏细胞结构所致；如保存时间在1周以内，可选择不经干燥，待其散粉后保存于4 ℃下即可；如保存时间较长，可经25 ℃干燥30 min后保存于-196 ℃环境，可延长保存时间。这与猕猴桃[7]、荔枝[28]、枣[29]等种质花粉在4 ℃、-20 ℃、液氮保存研究结果相似。即花粉超低温保存显著延长了花粉保存寿命，但如因条件不能达到-196 ℃，则可选择经25 ℃干燥30 min后保存于-20 ℃中也可延长保存时间。综合来看，如需长期保存，在25 ℃干燥30 min较为合适。而番茄[30]、魔芋[31]等材料的花粉则无需干燥，直接投入液氮保存即可达最佳效果，这可能与物种间遗传特性有关。在辣椒花粉的保存上，适当降低花粉含水量可以保持较高的活力[32]。而本研究中，干燥时间较长的花粉其萌发率也有所降低，这可能是由于物种间花粉内部结构的不一所致，如细胞内的结合水含量少，则会导致细胞过度失水而降低活力，因此应适当减少干燥时间。在花粉整个保存过程中，偶尔会出现后期花粉萌发率高于前一时期的花粉萌发率，这在其他的物种中也时常发生，但其原因目前尚不清楚[33]。

a，b，c，d分别代表在25 ℃条件下干燥0、30、60和180 min后保存不同时间的结果a，b，c and d represent the results of storing at different times after being dried at 25 ℃ for 0，30，60 and 180 minutes respectively图1 25 ℃下干燥不同时间后保存方法和保存时间交互作用下的花粉萌发率Fig.1 Interactive effect of storage methods and storage time on pollen germination rates after drying at 25 ℃

除保存方法外，预冻和解冻的效果因植物种类和花粉含水量的不同而有较大差异[34]。在甘蓝型油菜中，经变温预冻处理后液氮保存的花粉，逐步解冻法使花粉萌发率保持最高[35]。而在不同保存方式对扁桃花粉保存效果的影响研究中[6]，解冻方式以35 ℃解冻70s效果最好。本研究中，花粉在室温下解冻30 min后的萌发率相对较高，而在37 ℃水浴解冻5min的花粉全部丧失活力，这可能是由于解冻温度较高导致花粉出现破裂，进而导致花粉萌发率的丧失。比较分析显示，直接放入-80 ℃进行保存的花粉萌发率较高，这与唐菖蒲[22]的研究结果类似。

4 结 论

综上所述，如在1周内需对樱桃进行人工授粉，可选择处于大花蕾期取粉，然后保存于4 ℃；如需大于1周的长期保存，则应将花粉经25 ℃干燥30 min后，保存于-196 ℃，且在使用前应室温解冻30 min后，方可达到最佳效果。