胡椒CBF1基因克隆与表达分析

伍宝朵，胡丽松，范 睿，杨建峰，郝朝运

(1. 中国热带农业科学院香料饮料研究所, 海南 万宁 571533; 2. 农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室, 海南 万宁 571533; 3. 海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室, 海南 万宁 571533)

【研究意义】胡椒(Pipernigurm)是世界上最重要的香辛料作物，具有较高的经济价值[1-2]。目前胡椒种植已遍及亚州、非州、拉丁美洲近20个国家和地区，据联合国粮食及农业组织(FAO)统计，世界胡椒收获面积近50万hm2，总产量达45.4万t。中国胡椒主要分布在海南、云南、广东、广西和福建等省(区)，种植面积达3万hm2，年产量约3.60万t，位居世界第五[3]，其中海南是胡椒主产区，种植面积和产量均占全国90 %以上。随胡椒价格攀升，我国胡椒种植面积不断扩大，以云南省胡椒种植面积发展最为迅速[4]。近年来，寒害等极端气候频发，我国胡椒主栽胡椒品种热引1号胡椒不耐低温，受寒害后易出现落叶、断枝，甚至死亡，且伤口极易感染病害，易对胡椒产量造成严重影响[5-6]。因此，选育适合中国气候环境特点的高产、抗寒新品种是产业发展迫切需要解决的问题。【前人研究进展】An等[7]研究表明CBF/DREB1低温调控途径是植物抵御寒害的重要调节途径。CBF/DREB1转录因子是植物特有AP2/EREBP结合蛋白的转录因子，通过识别启动子区含有CRT/DRE元件的低温响应基因，从而激活基因转录[8]。AtCBFs基因在低温胁迫15 min后表达量增加，拟南芥中约12 %～20 %低温响应基因是被AtCBF1-3激活，包括COR基因、其他转录因子(RAP2.1)、渗透物质(脯氨酸、糖类、丙二醛等)合成酶等[8-9]。与AtCBF1相比，MeCBF1在低温胁迫4 h后才上调表达，拟南芥中过量表达MeCBF1也可增强其抗寒能力[10]。单、双子叶植物的CBF1基因具有相似的结构和保守的功能，在拟南芥中过量表达水稻[11]、桦木[12]及葡萄CBF1基因[13]也能够提高拟南芥抗寒性。【本研究切入点】综上所述，CBF/DREB1低温调控途径在植物抵御寒害中发挥了重要作用，在多种作物中已克隆并证明CBF1在植物抵御寒害中的作用。但胡椒中尚未见抗寒相关基因克隆的报道。【拟解决的关键问题】本研究拟通过同源序列法从胡椒中克隆CBF1基因，分析其表达模式，为今后胡椒抗寒分子机制研究奠定基础，对胡椒抗寒育种和基因遗传改良具有重要的理论及现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及处理 供试材料为热引1号胡椒(低温敏感)和石南藤(低温耐受)，保存于中国热带农业科学院香料饮料研究所“农业部万宁胡椒种质资源圃”。按照海南省地方标准“胡椒优良种苗培育技术规程”(DB46/T26-2012)，选取生长正常、无病虫害和机械损伤的热引1号胡椒和石南藤插条，在温室沙床中培育生根，生根后转移至育苗袋中抚育3个月，转移至人工气候箱KBWF720(宾德，德国)中进行低温处理。试验设置4 ℃低温胁迫，光照设置为12 h /12 h，相对湿度保持70 %左右，待温度降至待处理温度后开始计时。分别在低温胁迫0、12、24、48、72 h 采集叶片并迅速置于液氮中冷冻，将采好的样品保存于-80 ℃冰箱备用。重复3次，每次重复处理5株苗。

1.1.2 菌株及试剂 RNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒、大肠杆菌DH5α菌株购自天根生化科技(北京)有限公司，M-MLV逆转录酶、pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司，SYBR Green qRT-PCR试剂盒购自TOYOBO公司，测序和引物合成委托上海英骏生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA 提取、cDNA合成及胡椒CBF1基因克隆 提取胡椒组织总RNA，操作参照试剂盒提取方法。取2 μg RNA样品反转录合成第一链cDNA，具体方法参照说明书。胡椒EST数据库(SRX708503)与Genbank上公布的模式植物CBF1序列进行tBlastn搜索，依据搜索获得的CL5815.Contig1_All序列，利用Primer Primer 5软件设计扩增ORF特异性引物CBF22-F: 5′-TCCGACTTCTAAAAATGGCAAC-3′、CBF22-R: 5′-TTAAATGCTCAA ACAGAGTGG-3′。以热引1号胡椒和石南藤根、茎、老叶、嫩叶、花组织cDNA等量混合样为模板扩增，PCR体系为50 μl，PCR扩增参数为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测条带大小正确后，回收纯化目的条带，连接pMD18-T载体，热激转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆测序。

1.2.2 胡椒CBF1基因生物信息学分析 ORF和氨基酸序列分析分别利用NCBI ORF finder程序和在线网站(http://web.expasy.org/translate/)。利用在线网站(http://web.expasy.org/protparam/)预测CBF1基因蛋白理化性质，亚细胞定位使用PSORT Prediction进行分析。然后在NCBI 蛋白数据库中利用blastp搜索其他植物的CBF1并获取其序列，利用软件DNAMAN 6.0进行序列比对，利用MAGE4.0分析CBF1系统的进化关系。

1.2.3 胡椒CBF1基因的表达分析 根据胡椒CBF1基因的开放阅读框序列设计实时荧光定量引物qCBF22a-F: 5′-CAGCAGCTCCCATGTCAGTC-3′、qCBF22a-R: 5′-TCTGCGGTCGGGTGAGTG-3′; 以胡椒管家基因Polyubiquitin1作内参，内参引物为PUB1-F:5′-TTACCAGGACTCAGCAGCGAATG-3′、PU B1-R: 5′-AAGCCAATGACTTTACATCCTCCAG-3′[14]，实时荧光定量PCR在Life technologies QuantStudio 6 Flex荧光定量PCR仪上进行，PCR反应体系为20 μl，按照SYBR Premix ExTaqTM II试剂说明书进行。扩增参数为经典的2步法：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，共40个循环，每个样品重复4次，根据Ct值计算基因表达丰度，基因的相对表达量计算采用2-△△CT方法。

2 结果与分析

2.1 胡椒CBF1基因全长cDNA克隆

以热引1号胡椒和石南藤根、茎、老叶、嫩叶、花组织cDNA等量混合样为模板，利用特异性引物CBF22进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示获得约670 bp条带(图1)。经纯化、转化测序得到基因全长序列，通过GenBank Blast搜索比对，显示结果为AP2/EREBP结合蛋白(CBF1)，与白桦CBF1蛋白同源性达到54 %。该序列包含启始密码子为ATG，终止密码子为TGA，在热引1号胡椒中ORF全长为660 bp，命名为PnCBF1，编码220个氨基酸，石南藤中ORF全长为654 bp，命名为PwCBF1，编码218个氨基酸。

2.2 胡椒CBF1基因生物信息学分析

在热引1号胡椒和石南藤中，CBF1基因编码的氨基酸序列分子量分别为24.07和23.87 kD，等电点PI为4.82，分子式分别为C1057H1602N298O323S13和C1052H1599N295O321S11。预测蛋白的氨基酸组成中，氨基酸出现频率较高的是Ala、Glu Arg和Gly，在热引1号胡椒中分别占总氨基酸的14.6 %、8.7 %、7.8 %和8.7 %，在石南藤中分别占总氨基酸的15.7 %、9.2 %、7.4 %和7.4 %，Pyl和Sec则没有出现。分析发现胡椒CBF1具有56个氨基酸残基组成AP2 /EREBP结构域，2个保守的氨基酸序列位于AP2结构域的上游和下游，分别是PKK/RRAGRKKFRETRHP和DSAWR，其中PKK/RRAGRKKFRETRHP是核定位信号序列(NILs) (图2，封三)。通过NCBI Blast检索与胡椒CBF1基因编码氨基酸同源的序列，利用MEGA 4.0软件构建CBF1基因氨基酸序列进化树(图3)。结果表明，19种植物的CBF1被分成两个亚族(ClassⅠ和ClassⅡ)，ClassⅠ是由16种植物(包含橡胶、番茄等在内)的CBF1组成，ClassⅡ是由3种植物(水稻、玉米和二穗短柄草)的CBF1组成， PnCBF1和PwCBF1归属于该类，胡椒的CBF1与檀香的距离较近，与蔷薇科的苹果进化距离较远。

热引1号胡椒：Reyin-1；石南藤：SNTPiper nigrum cv. Reyin-1: Reyin-1; Piper wallichii: SNT图1 PCR扩增胡椒CBF1基因的琼脂糖凝胶扩增结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis result of PCR product of CBF1 gene in Piper L.

2.3 胡椒CBF1基因表达分析

以胡椒Polyubiquitin1基因作内参，以热引1号胡椒根部样品为对照，利用荧光定量PCR技术分析CBF1基因在胡椒不同组织中的表达模式。由图4可知，CBF1基因在热引1号胡椒和石南藤不同组织中表达量差异较大，在热引1号胡椒根、老叶、嫩叶、茎、花和石南藤老叶、嫩叶、茎、花中表达量极少，而在石南藤根中的表达量是热引1号胡椒根的198.14倍。

以胡椒Polyubiquitin1基因作内参，以低温胁迫热引1号胡椒4 h的样品为对照，分析低温胁迫不同时期热引1号胡椒和石南藤叶片中CBF1基因表达特征(图5)。结果表明：在低温胁迫前，CBF1基因在热引1号胡椒和石南藤的表达量均较低；4 ℃低温胁迫后，2个种质的表达量都显著增加，在热引1号中胡椒中，CBF1基因表达量呈现先升后降的变化趋势，其中胁迫48 h表达量最高，是对照的6.54倍，是胁迫前表达量的251.34倍；在石南藤中，CBF1基因表达量呈现双峰波动的变化趋势，胁迫4 h表达量达到最高，是对照的81.02倍，是胁迫前表达量的28.97倍。低温胁迫不同时期中，CBF1基因在石南藤中的表达量都显著高于热引1号胡椒，其中胁迫4 h时表达量差异最大。

3 讨 论

栽培胡椒起源或长期生长在热带、南亚热带地区，抗寒能力较弱，而我国胡椒种植在海南、云南、广东和广西各省，由于地理位置均存在不同程度的寒害问题。通过多年田间调查、盆栽试验表型和生理生化指标测定，在栽培胡椒种内未鉴定出抗寒的种质，从具有优良表型的近缘野生种着手，克隆抗寒关键基因，分析并进行功能验证，可为胡椒抗寒分子育种提供优异基因资源。植物感受低温信号诱导下游调控路径非常复杂，目前CBF/DREB1低温调控途径被学术界广泛认可。CBF同源基因已在多种低温耐受作物(小麦、大麦及油菜)[15-17]和低温敏感

图3 胡椒CBF1与其他植物CBF1氨基酸序列进化树Fig.3 Phylogenetic analysis of CBF1s from Piper L. with other CBFs

作物(水稻、玉米及番茄)[11, 18]中克隆。研究表明，CBF转录因子对基因的调控作用在不同植物物种的冷驯化进化中起着举足轻重作用。目前还没有关于胡椒抗寒分子机理方面的研究，本研究首次从胡椒寒害问题入手，克隆并表达分析CBF1基因为胡椒抗寒关键基因的挖掘奠定了基础。

CBF1基因属于AP2/ERF (APETALA2/Ethylene responsive factor)转录因子家族的一类成员，该家族基因编码约由58个氨基酸残基组成AP2 /EREBP 结构域和2个保守的氨基酸序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR)，保守氨基酸序列分别位于AP2 /EREBP 结构域的上游和下游。本研究克隆出的胡椒CBF1基因在热引1号胡椒和石南藤中的开放读码框分别为660和654 bp，分别编码220和218个氨基酸，具有同其他物种CBF1相似的保守结构域[14, 19]。通过氨基酸序列进化分析发现，19种植物的CBF1被分成2个亚族，ClassⅠ是由16种植物双子叶植物组成， ClassⅡ是由3种单子叶植物组成，胡椒CBF1属于ClassⅡ，表明CBF1基因在单双子叶植物分化前已经分化，之后随着物种的演化而进化。

图4 CBF1基因组织特异性表达分析Fig.4 Transcription pattern analysis of CBF1 in different tissues from Piper nigrum cv. Reyin-1 and Piper wallichi

在组织特异性表达研究中发现，CBF1基因在热引1号胡椒根、老叶、嫩叶、茎、花和石南藤老叶、嫩叶、茎、花中表达量极少，而在石南藤根中的表达量最高。在冰岛罂粟中，PnDREB1在花瓣，花梗，叶，叶柄，和根中都有表达，以根中表达量最高[20]。An等发现MeCBF1在木薯各组织中表达量也很低，其中在嫩茎中表达量最高，顶芽和茎形成层中表达量最低[10]。而AtCBF1基因在拟南芥根、茎、叶中均无表达[21]。通过以上研究可以推测CBF1基因在不同物种的进化中作用不同。

低温胁迫下，受Ca2+信号诱导，CBF/DREB1基因转录产物迅速积累，识别COR基因等低温响应基因启动子区的CRT/DRE元件，激活基因表达，从而增强植物对低温逆境的抗性。在本研究中，低温胁迫前，CBF1基因在热引1号胡椒和石南藤中的表达量均较低，低温胁迫后，CBF1基因在2个种质中的表达量均显著增加，且在不同胁迫时间其表达量显著差异。说明CBF1基因在热引1号胡椒和石南藤中受低温诱导表达，且表达量与胁迫时间相关。研究结果显示，低温胁迫4 h时，2个种质中CBF1基因的表达量分别是胁迫前的251.34和81.02倍，在热引1号胡椒中，胁迫48 h时CBF1基因表达量最高，而在石南藤中，胁迫4 h时CBF1基因表达量最高，随后显著性下降。表明低温胁迫后，CBF1基因在热引1号胡椒和石南藤中表达最高峰出现的时期不同，低温耐受种质石南藤的CBF1基因表达量在不同时期均显著高于低温敏感种质热引1号胡椒，这反映了2个种质对低温胁迫反应速度不同，表达量差异较大。在拟南芥中，CBF1基因在低温胁迫15 min后已经被诱导表达，2 h时表达量达到最高[22-23]。在冰岛罂粟中，PnDREB1在低温胁迫2 h表达量显著上升，8 h达到峰值，12 h后表达量降低到胁迫前水平[20]。这反映出不同物种CBF1基因对低温胁迫反应存在一定的差异。本研究中胡椒CBF1基因的克隆和表达分析为胡椒CBFs低温调控途径研究和抗寒分子机制研究奠定了基础。

图5 低温胁迫不同时期CBF1基因表达分析Fig.5 The expression analysis of CBF1 gene under low temperature in Piper nigrum cv. Reyin-1 and Piper wallichi

4 结 论

从热引1号胡椒和石南藤中克隆获得PnCBF1和PwCBF1，开放读码框长度分别为660和654 bp。实时荧光定量PCR分析结果表明CBF1基因在石南藤的根组织中高量表达，而在热引1号胡椒和石南藤的其他组织中均低量表达；低温胁迫后，CBF1基因在热引1号胡椒和石南藤中均受低温诱导表达，且在低温耐受种质石南藤中的表达量显著高于低温敏感种质热引1号胡椒。