长尖叶蔷薇基于rDNA FISH的核型分析

2018-11-30蹇洪英莫锡君邱显钦唐开学王其刚

西南农业学报 2018年10期

张婷，蹇洪英，莫锡君，邱显钦，杨静，唐开学，王其刚*

(1.云南省农业科学院花卉研究所/云南省花卉育种重点实验室/国家观赏园艺工程技术研究中心，云南昆明 650200；2.中国科学院昆明植物研究所，云南昆明 650201)

【研究意义】长尖叶蔷薇(RosalongicuspisBertol.)为蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(RosaL.)合柱组(SectionSynstylaeCD.)攀援灌木，广泛分布于西南三省，印度北部也有分布，植株高大、叶片光亮革质[1]，具有较好的抗寒性[2-3]及对白粉病菌免疫[4]等优良性状。云南地区的长尖叶蔷薇居群间存在中度遗传分化，居群遗传多样性较高[5]，是现代月季遗传育种的优良种质资源。【前人研究进展】核型分析是作物育种的基础。Akasaka等[6-7]和张婷等[8]发现蔷薇属植物中存在异形同源染色体，而以往的常规核型分析中均未有报道[9-18]，因此，以前的常规核型分析可能对染色体有误配。染色体荧光原位杂交(FISH)技术具有实验周期短、灵敏度高、分辨率高、直观可见等优点，可通过rDNA在染色体上的定位，清楚地识别形态相近的染色体[19]。由于蔷薇属植物的染色体为小染色体[6-7]，平均长度仅有2.81 μm[20]，利用基于rDNA FISH对其进行核型分析更为准确可靠。【本研究切入点】利用45S和5S rDNA为探针，对长尖叶蔷薇进行染色体荧光原位杂交研究，在对rDNA进行精确物理定位的同时获得长尖叶蔷薇更为准确的染色体核型数据。【拟解决的关键问题】本研究可为其在蔷薇属植物特别是现代月季的种质创新和遗传改良中提供分子细胞遗传学背景资料。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的长尖叶蔷薇来自云南省弥勒市，以嫁接苗的方式保存于云南省农业科学院花卉研究所月季种质资源圃中。

1.2 方法

1.2.1 探针标记 5S rDNA以PCR方法获得，上游引物：5’-GAGTAGTACTAGGATGGGTGACC-3’；下游引物:5’-CTCTCGCCCA ARCWCGCTTAACT -3’，由云南精赛顿生物科技有限公司合成，PCR扩增条件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 S，55 ℃ 30 S，72 ℃ 40 S，35个循环，72 ℃ 7 min。45S rDNA和5S rDNA按张婷等[8]的方法标记。

1.2.2 染色体制片、原位杂交、图像检测及分析染色体片子参考田敏等[21]的方法进行。原位杂交方法：a.杂交前的准备：选取染色体分散良好的制片；加100 μl 10～50 μg/mL的胃蛋白酶溶液于制片上，盖上封口膜，37 ℃孵育20～60 min；用ddH2O冲洗干净，用2×SSC洗2次每次5 min；将玻片于60 ℃烘箱中干燥2～3 h，放置至室温。配置杂交液30 μl [100 %去离子甲酰氨(Formamide)20 μl，50 %硫酸葡聚糖(DS)5 μl，20×SSC 2 μl，10 % SDS 1 μl，2种探针各1 μl]。混匀后于97 ℃变性10 min，迅速转入冰中0 ℃以下至杂交(10 min以上)。b.染色体变性：每个玻片加70 %去离子甲酰氨100 μl，盖上封口膜后于75 ℃变性3 min；70 %、95 %、100 %乙醇于-20 ℃下脱水，每级5 min；迅速甩干后进行杂交。c.杂交：将杂交液滴于玻片上，加封口膜盖片，转入50 ℃水浴中孵育15～20 h。d.洗脱和信号检测：杂交制片用2×SSC漂去盖片；0.1 %SDS(2×SSC)37 ℃3次，每级5 min；0.1 %SDS(0.2×SSC)37 ℃ 3次，每级5 min；2×SSC室温下冲洗2次，甩干制片；加50 μl/片现配的5 %BSA，盖上封口膜，37 ℃封阻30 min。以下步骤避光：甩干封阻液，加60 μl抗体混合液 [Avidin-FITC(10 mg/mL)、Anti-digoxigenin-rhodamine(10 mg/mL)各30 μl]，盖上封口膜，37 ℃孵育1 h；1×PBS漂去盖片，1×PBS/Teween20中，37 ℃ 3次，每级5 min；加含有100 mg/mL DAPI的抗荧光衰减剂，盖上干净的盖玻片。e.杂交图像在Zeiss荧光显微镜(Axiophot 2)下观察并获取，用Zeiss及Photoshop软件对图像分析、处理。选取分散良好、形态清晰、杂交信号清晰的5个体细胞中期染色体进行核型分析，核型分析按照李懋学和陈瑞阳[22]的标准，核型类型根据Stebbin[23]的分类标准划分，核型数据用Excel分析。

2 结果与分析

2.1 长尖叶蔷薇rDNA FISH核型分析

长尖叶蔷薇基于rDNA FISH的核型公式为2n=2x=14=10m+4sm，核型为2A型，染色体组由中长染色体(M1)和中短染色体(M2)组成(表1)。除4号和5号染色体为亚中部着丝点染色体(sm)外，其余均为中部着丝点染色体(m)，其中5号染色体是1对相对长度差异很大的异形同源染色体，二者的相对长度相差(2.03±0.14)%，其中较长染色体为中长染色体(M2)，相对长度为(7.96±0.33)%，臂比值为2.22±0.12，较短染色体为中短染色体(M1)，相对长度为(5.93±0.20)%，臂比值为1.85±0.10；4号的2条染色体的相对长度也有较大差异，它们的相对长度相差(0.64±0.01)%，2条染色体都为中短染色体(M1)，其中较长染色体的相对长度为(7.11±0.14)%，臂比值为1.81±0.10，较短染色体的相对长度为(6.47±0.13)%，臂比值为1.90±0.11(表2)。

表1 长尖叶蔷薇体细胞中期染色体基于rDNA FISH的核型参数及rDNA位置

表2长尖叶蔷薇4号、5号染色体基于rDNAFISH的核型参数及rDNA信号强弱

Table 2 Karyotype parameters of the 4th and 5th pair of chromosomes ofR.longicuspisbased on FISH with 45S and 5S rDNA as probes and the strength of rDNA signals

染色体名称Chromosome name45S rDNA信号强度 45S rDNA signal strength5S rDNA信号强度 5S rDNA signal strength相对长度(%)Relative length臂比值Arm ratio着丝点类型Centromere type染色体相对长度组成 Constitution of relative length两条同源染色体相对长度差值The relative length difference between the heteromorphic homologous chromosomes4号较长同源染色体2+7.11±0.141.81±0.10smM10.64±0.014号较短同源染色体10+6.47±0.131.90±0.11smM15号较长同源染色体3+2+7.96±0.332.22±0.12smM22.03±0.145号较短同源染色体2++5.93±0.201.85±0.10smM1

2.2 45S rDNA和5S rDNA在长尖叶蔷薇染色体中的精确定位

45S和5S rDNA在长尖叶蔷薇上分别检出1对和2对位点(图1)。45S rDNA有1对杂交位点，位于5号染色体整条短臂上(5S)，信号明显且2个信号强弱差异不大。5S rDNA有4个杂交位点，其中一对位点位于4号染色体长臂(4L)的近着丝粒处，2个位点的信号强度差异很大，位于较短染色体上的信号极强、另一个很弱；另一对位点位于5号染色体长臂(5L)上部，信号明显，2个位点的杂交信号均较弱，差异不大。

2.3 合柱组4个野生种的rDNA FISH差异

已有的研究表明，蔷薇属二倍体野生种中5S rDNA位点按是否与45S rDNA有共线性分为2种：只有1对位点的5S rDNA与45S rDNA没有共线性，即：与45S rDNA不在同1对染色体上；有1对以上5S rDNA位点的，其中1对与45S rDNA位于同一染色体上，其余位点位于其它染色体上[6-8,11]，长尖叶蔷薇属于后者。已有的研究显示，与长尖叶蔷薇同属于合柱组(SectionSynstylae)的野蔷薇(R.multifloraThunb.，2n=2x=14)、光叶蔷薇(R.wichurianaCrép.，2n=2x=14)及川滇蔷薇(R.soulieanaCrép.，2n=2x=14)的45S rDNA位点数均与长尖叶蔷薇相同，为1对(2个)，5S rDNA除野蔷薇为3个外，其余为2对(4个)，分布模式为后者(表3)[6,8]。

a, a’：45S rDNA(绿)和5S rDNA(红)与DAPI 复染的染色体(蓝)的合成图；b：长尖叶蔷薇有丝分裂中期染色体；c：45S rDNA 杂交信号(绿)；d：5S rDNA 杂交信号(红)a, a’: A merged image of the metaphase chromosomes and the FISH signals. 45S rDNA (green), 5S rDNA (red), DAPI (blue); b: Metaphase chromosomes; c: FISH signals of 45S rDNA (green); d: FISH signals of 5S rDNA (red)图1 长尖叶蔷薇中期染色体rDNA FISH及核型Fig.1 FISH localization of 45S rDNA and 5S rDNA on metaphase chromosomes of R. longicuspis and homologous pairing of chromosomes

45S rDNA位点总数/位置45S rDNA loci number/site5S rDNA位点总数/位置(个数)5S rDNA loci number/site45S rDNA 强弱差异45S rDNA signal intensity5S rDNA 强弱差异5S rDNA signal intensity野蔷薇 (R. multiflora)[6]2/7S3/3L (1), 7S (2)--光叶蔷薇 (R. wichurana)[6]2/7S4/5 L (2), 7S (2)--川滇蔷薇 (R. soulieana)[8]2/7S4/4L (2), 7L (2)2个信号略有差异4个信号较强,略有差异长尖叶蔷薇 (R. longicuspis)2/5S4/4L (2), 5L (2)2个信号略有差异位于4L的信号极强,其他3个信号较弱。

光叶蔷薇与45S rDNA有共线性的5S rDNA位于此对染色体的短臂上[6]，川滇蔷薇[8]及长尖叶蔷薇的这对5S rDNA则位于此对染色体的长臂上。川滇蔷薇与45S rDNA无共线性的1对5S rDNA位于4号染色体，这对5S rDNA的信号强度虽有差异但不显著；长尖叶蔷薇的这对5S rDNA位于5号染色体，二者的信号强度差异极其显著。由rDNA的分布和杂交位点的特征可将这4种亲缘关系很近的物种在染色体水平上区分开(表3)。这4个种的5S rDNA有类似的分布模式，但又有各自不同于其它种的特征，可见rDNA FISH是进行细胞分子遗传学研究的有力工具。

3 讨论

Jian等经常规核型分析获得的长尖叶蔷薇的核型与本研究的结果不同：核型公式为2n=2x=14=12m+2sm，染色体组成中多了长染色体(L)，其中，仅第4对为亚中部着丝粒染色体(sm)，属于中短染色体(M1)，臂比值为2.77，此对染色体的相对长度之和为13.65，平均每条染色体为6.825，其余均为中部着丝粒染色体(m)[9-10]。经rDNA FISH核型分析的第4对和第5对染色体的两条相对较长染色体的相对长度较接近，另外两条较短染色体的相对长度也较接近，经常规核型分析时易被各配为1对，Jian等分析的第4对sm染色体很可能是由前者组成；另外，少了一对sm染色体可能跟材料预处理等有关。

已有的研究表明，蔷薇属植物的45S rDNA几乎都定位在1对异形同源sm染色体的短臂上[6-8,11]，5S rDNA所定位的染色体表现了更丰富的多样性，在种类和种间均有差异，有的是异形同源sm染色体，有的不是异形同源染色体，这在以往的常规核型分析研究中未见报道[9-18]。由于异形同源染色体存在显著的长度差异，常规核型分析时不会将它们配为一对。因此，基于rDNA FISH的核型分析结果更准确，对蔷薇属植物的遗传育种更具指导意义。