DNA分子荧光探针的种类及特点概述

张璐瑶 石晓明 杜亚丹 陈亚红 杨志广

(河南省周口师范学院化学化工学院 466001)

DNA作为遗传信息的携带者和基因表达的物质基础，在生物体的生长、发育、衰老、遗传和变异等生命过程中起着极为重要的作用。因此，准确快速、专一性识别和检测生物体内的DNA在生物医学领域有着非常重要的意义。目前测定DNA的分析方法有很多种，其中荧光探针技术是一种借助荧光显微镜在分子水平上进行实时监测的重要技术手段，具有灵敏度高、选择性好、可视性强、无损伤、操作方便，在生物学分析中受到了人们的广泛关注和研究。因此，发现和合成新型多功能监测生物内DNA动态变化的荧光探针对于研究细胞的生理和病理过程具有十分重要的意义。本文主要分析了DNA分子荧光探针的研究现状以及发展前景。

荧光探针与DNA分子之间主要有三种作用方式： 静电作用、嵌插作用和沟槽作用。目前用于研究和测定DNA分子的荧光探针有很多种，主要包括有机荧光染料类、金属离子类、金属离子配合物类、纳米粒子类和量子点类等DNA分子荧光探针。

1 有机荧光染料类荧光探针及其特点

有机染料是最早发展起来研究核酸的荧光探针，主要包括溴化乙啶、菁类染料、菲啶和吖啶类染料、中性红、甲基蓝以及氟化硼二吡咯(BODIPY)类染料等。这些有机荧光染料类荧光探针一般会与DNA分子发生较明显的嵌插作用，使体系的荧光强度明显增强，从而实现对DNA分子的检测，进而分析小分子化合物与DNA之间的相互作用方式及作用机理。Zheng等[1]基于双咔唑-菁染料设计合成了一个双光子DNA荧光探针，该探针与DNA结合后，斯托克斯位移(Stokes shift)较大，双光子荧光强度增强30倍，具有低毒性、良好的生物相容性和较强的细胞染色能力，能够应用于活细胞DNA的双光子生物荧光成像。Du等[2]基于BODIPY衍生物报道了一系列检测DNA的荧光探针，这些探针灵敏度高、选择性好、与DNA有较强的亲和力，具有较好的活细胞DNA成像能力。

2 金属离子类荧光探针及其特点

金属离子主要涉及稀土离子，如Tb3+和Eu3+等，这是由于稀土离子与DNA具有很强的结合力，与DNA作用后能够发射出稀土离子本身的特征荧光，具有光谱线宽窄、荧光寿命长、Stokes shift大等优良光学性能，可提供有关DNA及其组成的信息。Tong等[3]用溴化乙啶探针、紫外、荧光和圆二色光谱研究了百枯草与DNA的相互作用，证实Tb3+作为荧光探针与DNA链上带负电荷的磷酸以静电吸引的方式结合，对百枯草与DNA的结合具有明显的抑制作用。

3 金属离子配合物类荧光探针及其特点

由于金属离子具有独特的电子层结构、发射光谱窄、光化学稳定以及荧光寿命长等优点，因此得到了广泛关注。利用金属离子配合物荧光探针研究DNA可以从分子水平上探索DNA的结构、染色体变异、药物的作用机理以及为新的药物设计提供更有效的理论指导。根据发光体的差异可将金属离子配合物荧光探针分为金属离子发光的和配体发光的金属配合物荧光探针。罗黎等[4]合成了氧氟沙星-Tb3+配合物荧光探针，利用荧光光谱、紫外光谱研究了DNA对氧氟沙星-Tb3+配合物体系的荧光增强效应。结果表明，DNA加入氧氟沙星-Tb3+配合物后，形成了氧氟沙星-Tb3+-DNA三元络合物体系，荧光显著增强，线性范围为5.0×10-6～1.0×10-4mol/L，检出限为1.7×10-6mol/L，选择性好，与DNA的结合方式主要是沟槽式结合。杨欢春等[5]分别以La3+、 Eu3+、 Tb3+和Ce3+中心离子，合成了3-羟基-2-萘醛缩氨基硫脲稀土配合物，并通过紫外光谱、荧光光谱和黏度法等技术研究了配合物和DNA的相互作用模式。结果表明，配合物以插入的方式与DNA相结合。王凯等[6]以5-(4-羟基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉和钌-菲罗啉衍生物为原料，合成了3种钌-菲罗啉卟啉化合物(Por1、 Por2和Por3)，并采用紫外光谱、荧光光谱和圆二色光谱测试了它们与DNA相互作用的方式。结果表明，Por1和Por2与DNA的结合方式均为凹槽的插入模式和外部结合共存，而Por3则采取自堆积的外部键合方式与DNA结合，该类配合物在光动力学治疗中具有诱人的应用前景。Wang等[7]基于邻菲罗啉衍生物设计合成了一类检测线粒体DNA的双光子金属钌配合物荧光探针。该探针具有较好的双光子吸收性能、良好的生物相容性、选择性好、自发荧光小，实现了活细胞以及活组织中DNA的双光子生物荧光成像，在生物过程中具有潜在的应用价值，为直接监测活细胞中的线粒体DNA提供了一个有潜力的研究平台。

4 纳米粒子类荧光探针及其特点

纳米金由于其表面积大、稳定性好、易于制备、粒径可控、良好的生物相容性以及独特的光电特性等特点，在生物医学领域得到了日益广泛的应用。董晓娅等[8]以亚甲蓝为电活性标记物，利用原位制备的纳米金膜和稳定的Y型DNA设计合成了一种性能优异的DNA电化学生物传感器。与传统的传感器相比，该传感器具有选择性好、背景电流小、线性范围宽、抗干扰能力强等特点，另外，该传感器也表现出了良好的重现性和稳定性。

5 量子点荧光探针及其特点

量子点荧光探针是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素组成的能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，粒径在1～100nm间，具有尺寸效应、量子限域效应、表面效应、宏观量子隧道效应等性质。而且量子点具有摩尔消光系数大、吸收波长宽且连续、荧光发射波长窄而对称、Stokes shift大、光漂白作用小、光稳定好以及颜色可控等特点。因此，量子点作为生物标记物具有有机染料无法比拟的优势。胡先运等[9]利用巯基丙酸包覆的InP@ZnS量子点与带正电的Dured核酸染料通过静电结合，构建了一种检测DNA的荧光探针。通过荧光共振能量转移机理(FRET)，Dured核酸染料-InP@ZnS量子点荧光产生淬灭效应，当Dured与DNA的特异性结合后，FRET过程被打断，InP@ZnSQDs荧光恢复。该探针可用于模拟生物生理条件下的DNA检测，具有选择性好、检测线性范围宽、检测限低等特点，为核酸的定量分析以及小分子药物筛选开辟了新的途径。

6 展望

DNA是生物体内重要的遗传物质，实时准确地检测细胞中DNA的含量对于某些疾病的诊断与治疗具有重要意义。本文主要介绍了DNA分子荧光探针的研究现状，虽然有很多种DNA荧光探针或检测方法被报道，但还存在一些亟待解决的问题： ①开发专一性、荧光量子效率高、背景干扰小的DNA荧光探针；②开发具有水容性好、生物透膜性好、生物相容性好以及无毒性的DNA荧光探针；③合成具有高灵敏度、大双光子吸收截面及大Stokes shift、能够对活细胞和深层组织成像的双光子DNA荧光探针；④加大探针与DNA分子之间的反应机理以及生物学机制研究，为生物研究和医学诊断提供理论基础。总之，在众多科学工作者的努力下，DNA分子荧光探针将会获得进一步发展，并在生命科学领域展现更加广阔的应用用前景。