黄芩提取物逆转细菌耐药性及对16S rRNA甲基化酶基因表达影响的研究*
2018-11-29蒋文捷梁雪梅西南医科大学附属医院老年科四川泸州646000
蒋文捷,梁雪梅(西南医科大学附属医院老年科,四川泸州646000)
随着抗菌药物的广泛使用,细菌等病原体耐药问题日趋严重,如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐药绿脓杆菌及大肠杆菌在内的多种引起医院获得性感染的病原体已经对β-内酰胺类、喹诺酮及大环内酯类等临床常用抗菌药物表现出耐药现象[1-4]。因此,找到对耐药菌株具有抑制作用的新型抗菌药物,恢复或部分恢复抗菌药物敏感的化合物逐渐成为研究热点[5]。通过对清热解毒类中药提取物进行分析和研究,本研究发现黄芩提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐药铜绿假单胞菌和耐药肺炎克雷伯菌的生长具有抑制作用,同时可以抑制16S rRNA甲基化基因的表达,提高耐药菌对氟喹诺酮类抗菌药物的敏感性。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料 选取2017年1月本院临床患者体液及分泌物标本中培养鉴定的菌株90份,包括耐药金黄色葡萄球菌、耐药铜绿假单胞菌和耐药肺炎克雷伯菌。黄芩提取物(购自四川世坤植物有限公司)主要成分包括黄芩苷、绿原酸等。
1.2 方法
1.2.1 供试品菌液的配制 将前期实验鉴定得到的耐药绿脓杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及耐药肺炎克雷伯菌接种到血平板(重庆庞通医疗器械有限公司)上培养,并根据菌落进行纯化,于37℃条件下培养24 h。培养结束后将细菌从培养基中挑出,并与生理盐水调节细菌浓度至0.5麦氏浊度。
1.2.2 供试品溶液的配制 精密称取1.0 g黄芩提取物于试管内,加入1 mL生理盐水震荡使提取物充分溶解,制成黄芩提取物供试品溶液;精密称取0.5 g环丙沙星、万古霉素和氨曲南(浙江医药股份有限公司新昌制药厂),加入1 mL生理盐水并震荡使溶解充分,分别制成环丙沙星、万古霉素和亚胺培南供试品溶液,所得溶液经过0.22 μm微孔滤膜过滤备用。
1.2.3 药物敏感度测定 药物敏感试验采用纸片扩散法(κ-B)法进行,具体步骤如下:高温灭菌后的专用药敏纸片浸于100 μL抗菌药物溶液或黄芩提取物溶液中,吸收饱和取出晾干,并再次供试品溶液,直至吸收完全。细菌溶液均匀涂布在5只MH平板上,平板用无菌镊子在平板的左右两边各放3片纸片,左边的纸片上依次加入环丙沙星溶液、黄芩提取物溶液和环丙沙星+黄芩提取物溶液,右边的纸片上依次加入生理盐水、万古霉素和氨曲南溶液(对照组)。于37.5℃条件下培养24 h后测定抑菌圈大小,并计算抑菌圈大小的平均值和标准差。
1.2.4 耐药菌16S rRNA甲基化酶基因检测 取耐药菌菌落,分别接种于普通LB液体培养基、含环丙沙星500 mg/L的LB培养基、含黄芩提取物1000 mg/L的LB培养基,以及含黄芩提取物1000 mg/L+环丙沙星500 mg/L的LB培养基上,37℃条件下震荡培养过夜。
耐药菌16S rRNA甲基化酶基因表达采用反转录荧光定量聚合酶链反应方法进行检测,armA和rmtB引物设计按照文献[6-7]设计,其中 armA 引物:(P1)5′-AGG TTG TTT CCA TTT CTG AG-3′,(P2)5′-TCT CTT CCA TTC CCT TCT CC-3′;rmtB 引物:(P1)5′-ATG AAC ATC AAC GAT GCC C-3′,(P2)5′-CCT TCT GAT TGG CTT ATC CA-3′。采用25 μL反应体系对目标产物进行扩增,包括上下游引物各 1.25 μL、Taq 酶 12.5 μL、DNA模板3 μL和蒸馏水7 μL。实验操作严格按照试剂盒说明书进行,具体条件如下:95℃条件下预变性3 min;92 ℃ 30 s,55 ℃ 35 s,72 ℃ 30 s,进行 40 个循环。循环反应完成后,保持72℃5 min,反应结束后取10 μL扩增产物用含溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶电泳进行分析,并扫描拍照。
1.2.5 荧光定量聚合酶链反应 采用25 μL反应体系对目标产物进行扩增,包括上、下游引物各1.25 μL、Taq 酶 12.5 μL、DNA 模板 3 μL,荧光染料 SYBR green 2.5 μL和蒸馏水4.5 μL。实验操作严格按照试剂盒说明书进行,具体条件如下:95℃条件下预变性3 min;92 ℃ 30 s,55 ℃ 35 s,72 ℃ 30 s,进行 40 个循环。循环反应完成后,保持72℃5 min,终止反应。设置5个标准滴度质粒作为阳性对照,浓度分别为1x103、5x103、1x104、5x104、1x105copies/μL。每个实验重复 4 次,记录平均值和标准偏差。
1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行分析,计量资料以表示,2组间比较采用非配对t检验,多组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 黄芩提取物、环丙沙星等对3种不同耐药菌的抑菌圈直径比较 黄芩提取物对耐药金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用,其抑菌圈直径较对照组及环丙沙星显著提高,差异有统计学意义(t=15.57、13.47,P<0.01);黄芩提取物对金黄色葡萄球菌抑菌圈的直径略小于万古霉素,差异无统计学意义(t=1.27,P>0.05)。
黄芩提取物、环丙沙星对耐药铜绿假单胞菌和耐药肺炎克雷伯菌的抑制作用较差,其抑菌圈直径与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。而氨曲南对这2种耐药菌具有良好的抑制作用,其抑菌圈直径较对照组显著增高,差异均有统计学意义(t=24.34、26.21,P<0.01)。黄芩提取物+环丙沙星联合可有效提高铜绿假单胞菌和耐药肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径,差异均有统计学意义(t=21.57、20.40,P<0.01)。另外,黄芩提取物+环丙沙星的治疗效果与阳性对照药物氨曲南相似,抑菌圈直径比较,差异均无统计学意义(t=1.05、1.99,P>0.05)。见表 1。
表1 黄芩提取物、环丙沙星等对3种不同耐药菌的抑菌圈直径比较(n=5,mm)
2.2 黄芩提取物、环丙沙星对耐药菌16S rRNA甲基化酶基因表达的影响 在耐药菌中,armA基因检查结果呈现阳性,而rmtB基因检查结果呈现阴性。黄芩提取物对3种不同耐药菌株16S rRNA甲基化酶基因表达具有不同程度的抑制作用,其对耐药金黄色葡萄球菌的作用十分明显,而对耐药肺炎克雷伯菌的作用稍弱;同时,黄芩提取物可以降低耐药铜绿假单胞菌中armA的表达,但作用相对较弱。环丙沙星对3种耐药菌armA基因表达的作用不明显。另外,黄芩提取物+环丙沙星可以有效降低耐药菌株armA的mRNA水平,作用优于单独使用上述药物。见图1、2。
3 讨 论
黄芩是临床常用的中药之一。研究表明,中药黄芩可以通过多种不同机制控制耐药菌引起的感染及炎性反应,如:黄芩中的主要成分黄芩苷对耐药结核杆菌引起的金属蛋白酶、白细胞介素-10等免疫抑制及血管生长因子分泌具有良好的抑制作用,从而控制耐药结合杆菌的增殖[8];黄芩提取物对淋球菌耐药株的体外繁殖具有抑制作用,可以用于抗菌药物敏感性较低的淋球菌感染及难治性淋病[9];同时,黄芩提取物对多重耐药鲍曼不动杆菌具有良好抑制作用,而且抗菌作用具有剂量依赖性,当黄芩提取物浓度超过40 mg/mL时可以完全抑制鲍曼不动杆菌耐药株增殖[10];另外,黄芩组成的复方制剂对耐药超级细菌具有良好抑制作用,与β-内酰胺类抗菌药物联合后对超级细菌的抗菌作用明显增强,远高于抗菌药物及黄芩苷单独用药的抗菌能力[11]。进一步的研究表明,黄芩增强抗菌药物抗菌作用机制与耐药性逆转作用有关,黄芩等中药提取物可以抑制广谱β-内酰胺酶活性与表达,且抑制作用具有剂量依赖性[12],并且对革兰阳性菌的作用显著高于革兰阴性菌[13]。上述结果表明,黄芩及其提取物可能通过改变耐药相关酶类的表达及活性,逆转细菌耐药,从而提高耐药菌对抗菌药物的敏感性。
图1 黄芩提取物、环丙沙星对3种耐药菌armA mRNA转录的影响
图2 黄芩提取物、环丙沙星对3种耐药菌armA mRNA循环阈值(Ct值)的影响
16S rRNA甲基化酶与氨基糖苷类抗菌药物耐药及超级细菌的形成密切相关,其不仅可以导致氨基糖苷类高水平耐药,同时编码于质粒上的酶基因可与β-内酰胺酶及氟喹诺酮耐药因子一同转移和表达[14-15]。16S rRNA甲基化基因包含armA、rmtB及rmtC 3部分,其中关于armA的研究最为深入。有研究表明,armA的表达与氨基糖苷类抗菌药物的短期和长期耐药、β-内酰类抗菌药物耐药,以及碳青霉烯类抗菌药物的耐药有密切联系[16-19]。也有研究表明,抗菌药物类药物可以通过16S rRNA途径诱导β-内酰胺酶和氟喹诺酮耐药基因的转录和翻译[20]。因此,降低16S rRNA的转录和表达,可提高耐药菌对抗菌药物的敏感性,同时为逆转致病菌耐药提供新的治疗方法。
本研究结果显示,黄芩提取物本身抗菌作用有限,与抗菌药物联用可提高抗菌效果。黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大于环丙沙星,差异有统计学意义(P<0.05);其抑菌圈直径较万古霉素稍小,差异无统计学意义(P>0.05)。因此推测黄芩对耐药金黄色葡萄球菌的作用可能直接通过抑制细菌生长和繁殖实现,armA基因表达量的减少可能与培养基中活菌数量的下降有关。
与金黄色葡萄球菌不同,黄芩对肺炎克雷伯菌及耐药铜绿假单胞菌的生长繁殖的抑制效果较差,抑菌圈大小显著低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);同时,环丙沙星对于上述耐药菌生长繁殖的抑制作用也十分有限。然而,黄芩提取物+环丙沙星可有效提高抑菌圈直径,其抑菌圈的大小稍低于对照组,差异无统计学意义(P>0.05)。提示黄芩提取物对armA的基因表达具有显著的抑制作用。因此推测对于耐药肺炎克雷伯菌和耐药铜绿假单胞菌,黄芩提取物的主要作用为抑制16S rRNA甲基化酶基因的表达,从而抑制细菌药物代谢及外排相关酶类的表达,从而提高对抗菌药物的敏感性。对于上述细菌感染,联合治疗的效果优于药物单独治疗。另一方面,联合治疗可以有效抑制耐药细菌的生长繁殖。因此,接受联合治疗的耐药菌armA基因的表达较单纯接受黄芩提取物治疗的细菌更低。
但是,黄芩提取物的作用机制尚需进一步研究,如:黄芩提取物的成分较为复杂,其中抑制细菌生长繁殖的有效成分及抑制armA基因转录的主要有效成分可能并不相同,因此,如何确定其中各种成分含量及不同组分的药理作用依然需要进一步研究;同时,不同成分的相互作用可能影响有效成分的代谢及组织细胞分布。因此,黄芩提取物体外作用及作用机制与体内作用及作用机制是否相同,仍然需要进一步研究。
综上所述,中药黄芩提取物具有清热解毒作用,可以有效抑制耐药金黄色葡萄球菌的生长繁殖,同时抑制耐药铜绿假单胞菌及耐药肺炎克雷伯菌16S rRNA甲基化酶基因转录,提高耐药菌对抗菌药物的敏感性,从而提高抗菌药物的抑菌作用。