木香烃内酯对肺癌细胞A549的凋亡作用及其机制*

罗 雪，彭建明，江秀玲（扬州市职业大学医学院，江苏 225009）

木香烃内酯是从中药木香、月桂树、荷花、玉兰等植物中提取的主要化学成分，具有多种药理学和生物化学活性[1]。研究表明，木香烃内酯可降低血糖，能抑制机体对酒精的吸收，有抗炎、抑制微生物活性和抗肿瘤等多种药理学功能[2⁃4]。然而关于木香烃内酯在肺癌中作用的报道较少见。本研究以人非小细胞肺癌A549细胞为模型，分析了木香烃内酯对肺癌细胞的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人非小细胞肺癌A549细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。木香烃内酯购自上海诗丹德生物公司，纯度大于98%，用二甲基亚砜（DMSO）配置成200 mmol/L备用；胎牛血清和DMEM培养基均为美国Gibco公司产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）购自AMRESO公司；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒为上海碧云天生物技术公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，放于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱中进行培养。以下各实验部分所用细胞均为对数生长期的细胞。

1.2.2 细胞体外生长 取对数生长期的细胞，将细胞浓度调整为5×104mL-1，以每孔100 μL接种于96孔板中，加入不同浓度的木香烃内酯（3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 和 100.000 μmol/L），分别为 a、b、c、d、e、f组，对照组加入0.1%DMSO，48 h后采用MTT法测定肿瘤细胞活性。每孔加入10 μL MTT，混匀后在37℃温度下培养4 h，然后吸弃上清液，每孔加入100 μL DMSO，使用酶标仪测定在492 nm处的吸光度值（OD）。抑制率=（1-各剂量组OD/对照组OD）×100%。

1.2.3 细胞凋亡比例 细胞与不同浓度药物孵育48h后，收集细胞并用 10 μg/mL Annexin V⁃FITC 和 20 μg/mL PI进行染色，使用流式细胞仪检测细胞凋亡比例。

1.2.4 Bax mRNA和Bcl⁃2表达 细胞经木香烃内酯处理后，用Trizol法提取总RNA，反转录为第一链互补DNA（cDNA），然后以cDNA为模板，采用反转录⁃聚合酶链反应（RT-PCR）测定细胞内Bax和Bcl⁃2基因表达情况。内参基因为甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（GAPDH），引物如下：Bcl⁃2 上游引物为 5′⁃GGT CGC CAG GAC CTC GCC GC⁃3′，下游引物为 5′⁃AGT CGT CGC CGG CCT GGC G⁃3′；Bax 上游引物为 5′⁃GAG CTG CAG AGG ATG ATT GC⁃3′，下游引物为 5′⁃AGC CCA ACA GCC GCT CCC GG⁃3′；GAPDH 上游引物为 5′⁃GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT⁃3′，下游引物为 5′⁃GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG⁃3′。

1.3 统计学处理 采用SPSS12.0软件进行统计学处理，计量资料以表示，组间比较采用One⁃way ANOVA检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 木香烃内酯抗肿瘤细胞增殖 木香烃内酯对肺癌细胞A549的生长具有显著抑制效果，木香烃内酯各剂量组与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），而且随药物剂量的不断增加，其抑制效果更加显著。见图1。

图1 木香烃内酯处理后对肺癌细胞A549增殖作用

2.2 木香烃内酯对肺癌细胞A549凋亡的影响 d、e、f组经木香烃内酯处理肺癌细胞A54948 h后，其凋亡率分别为（6.90±0.32）%、（28.07±0.22）%和（46.92±0.44）%，与对照组的（2.51±0.28）%比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 2。

2.3 木香烃内酯对肺癌细胞A549 Bax和Bcl⁃2基因表达作用 与对照组比较，d、e、f组经木香烃内酯组细胞内Bcl⁃2基因表达水平明显下降，而Bax基因表达水平显著升高，Bcl⁃2/Bax比值也明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 3、4。

图2 木香烃内酯处理后对A549细胞凋亡作用

图3 木香烃内酯处理后对A549细胞基因表达作用

图4 木香烃内酯处理后对A549细胞Bax/Bcl-2比率的影响

3 讨 论

近年来，越来越多的科研工作者专注于抗癌中草药的研发。研究表明，木香烃内酯具有比较广泛的抗癌功能，对多种类型的恶性肿瘤如胃癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、白血病、肝癌和肺癌等都具有较好的抑制作用[4⁃7]。本文对木香烃内酯抗人非小细胞肺癌A549细胞的作用进行了研究，结果显示，木香烃内酯能有效地抑制人非小细胞肺癌A549细胞增殖，并诱导其凋亡。

细胞凋亡又称为程序性死亡，最初表示在机体发育过程中一种具有典型形态学特征的细胞死亡方式，多种病理学因素可以诱导细胞凋亡。细胞增殖和细胞凋亡的失衡在某些肿瘤的病理过程中起着非常重要的作用。凋亡的主要特征有细胞皱缩、膜翻转、DNA梯状条带等[8⁃10]。细胞凋亡是一个主动由基因调控的生物学过程，因此能够通过开发调控细胞凋亡相关蛋白的药物来掌控细胞凋亡，Bcl⁃2家族蛋白便是其中的典型代表[11]。Bcl⁃2 家族主要分为两类：抑制凋亡蛋白（如 Mcl⁃1和 Bcl⁃2 等）和诱导凋亡蛋白（如 Bax和 Bad 等）[12⁃13]。有研究显示，Bcl⁃2蛋白能够抑制线粒体膜间隙分子从线粒体释放到细胞质，表明Bcl⁃2在线粒体凋亡通路中起了重要作用[12]。此外，Bcl⁃2还被发现能够影响细胞内钙内流。凋亡诱导信号能够诱导钙离子从内质网中释放，线粒体中钙离子过载后导致线粒体基质膨大，进而引起线粒体膜电位失势，而Bcl⁃2能够降低内质网中钙离子的释放，使细胞对凋亡不敏感，而Bax的作用则相反，能够增加内质网中钙离子的释放[9，12⁃13]。本研究结果显示，木香烃内酯通过抑制Bcl⁃2表达和促进Bax表达来诱导细胞凋亡，从而达到抑制肺癌细胞增殖的目的，提示Bcl⁃2和Bax参与木香烃内酯介导的肺癌细胞凋亡。有研究显示，细胞凋亡过程中存在促凋亡蛋白Bax的增加和抑制凋亡蛋白 Bcl⁃2 的降低[8⁃10]。因此，Bcl⁃2/Bax 是细胞凋亡的重要指标之一。本研究结果显示，经木香烃内酯处理后，肺癌细胞内Bcl⁃2/Bax比值显著下降。

综上所述，木香烃内酯能显著抑制人非小细胞肺癌A549细胞增殖，并促进该细胞凋亡，其机制可能是通过降低Bcl⁃2表达，升高Bax表达，从而诱导该细胞发生凋亡。