IL-1β及其受体在雌牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中的表达定位
2018-11-29王靖雷潘阳阳何翃闳黄玉风樊江峰余四九
王靖雷,王 萌,潘阳阳,李 秦,何翃闳,黄玉风, 赵 凌,樊江峰,崔 燕,余四九
(甘肃农业大学 动物医学院/甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州 730070)
细胞因子最初被认定为免疫细胞分泌的肽和蛋白产物,在胚胎发育的子宫内膜生理和母体调控中发挥着重要作用[1-2]。在哺乳动物中,细胞因子表达失调可能会导致植入和胎盘形成异常[3]。白细胞介素-1(IL-1)是一种主要的促炎性细胞因子,在脊椎动物的母-婴交流界面局部调节子宫内膜许多生理功能[4]。 IL-1系统由2种激动剂(IL-1α,IL-1β),拮抗剂(IL-1受体拮抗剂,IL-1RN)和受体家族组成。 IL-1受体家族由I型( IL1R1)和II型(IL1R2)IL-1受体和IL1R辅助蛋白(IL1RAP)[5]组成。 IL-1α(IL1A)和 IL-1β(IL1B)都能与 IL1R1和IL1R2结合,而IL1RAP不能识别配体,但能增加白细胞介素的受体亲和力[6]。只有IL1R1转导信号应答IL-1,而IL1R2通过竞争IL-1结合来抑制IL-1的活性[7]。IL-1系统在人[8]、小鼠[9]、牛子宫内膜和子宫液[10-11]均有表达,同时在人类、小鼠、猪、牛胚胎中以及猪的子宫液中均检测到IL-1β[12-13]。受体IL1R1在人、鼠[12]、猪[14]和牛子宫内膜[15]和植入前人和小鼠胚胎中均存在[13,16]。来自不同物种的植入前胚胎产生并应答IL-1[12,17-21]。在人上,植入前胚胎在培养过程中释放IL-1β进入培养基[22-23],表明IL-1β分泌可以预测胚胎发育的潜能,且可作为怀孕的评价指标。表明IL-1β和 IL1R1在多种哺乳动物的生殖过程具有重要生物学作用,但相关机制还在进一步研究中,且存在一定的物种特异性。
牦牛(Bos grunniens)为生活在高寒低氧地区的珍稀高原物种[24],是世界上罕见的物种资源之一。与其他家畜相比,牦牛繁殖性能差,且很少应用生物技术[25]。因此,牦牛作为高寒低氧环境哺乳动物生理特性研究的典型,研究 IL-1β和 IL1R1参与牦牛生殖生理调控对高寒低氧环境哺乳动物辅助繁殖技术的提高具有重要意义。
胚胎体外培养的质量取决与培养基和培养条件,多种因子协同可促进胚胎发育[26]。在牛上,授精后8~10 h添加 IL1β可提高胚胎发育到囊胚期的比例[27],但 IL1β对哺乳动物胚胎发育的调控作用是否存在物种特异性仍需证实。因此,本研究检测 IL-1β和 IL1R1在牦牛发情周期各生殖系统的表达和分布,并分析其在胚胎发育过程中的表达水平,旨在将胚胎发育和生殖器官有效结合,阐明 IL-1β和 IL1R1在牦牛生殖生理调控中的潜在作用,为进一步研究 IL-1β和 IL1R1对牦牛胚胎发育的作用机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
TCM-199、D-PBS、离子霉素(Ion)、6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)购自Sigma公司。胎牛血清(FBS)购自Thermo Fisher Scientific公司;G1/G2联合培养液购自Vitrolife公司;SOFaa培养液为国产分析纯试剂配制;组织和胚胎RNA提取试剂盒购自Omega公司;两步法反转录试剂盒购自Promega公司,SYBR GreenⅡ荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司,蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)所用试剂均购自南京碧云天公司,其他试剂均为国产分析纯。免疫组织化学染色试剂盒(包括A 液:10%非免疫动物血清;B 液:山羊抗家兔 IgG;C液:辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素液)、Rabbit Anti-IL-1Beta、Rabbit Anti-IL-1R1、Goat Anti-rabbit IgG/HRP均购自北京博奥森生物工程有限公司。
1.2 样品收集
1.2.1 组织样品采集 2017 年 9 月在青海省西宁市乐家湾屠宰场采集样品。挑选卵泡期、黄体期和妊娠期健康母牦牛各3 头(各繁殖生理阶段分别处于同一时期,年龄接近),颈动脉放血致死解剖后迅速采集卵泡期后期(有优势卵泡>6 mm,子宫黏液和弹性)、黄体期后期(可见多个黄体)同侧的卵巢、输卵管和子宫,及妊娠期早期(胚胎约长 2.3 cm)妊娠侧的卵巢、输卵管、子宫和胎盘,无菌生理盐水对其冲洗干净并修剪后,用锡箔纸将其包裹放入预先标记好的布袋中,速投入液氮中带回实验室,存于―80 ℃超低温冰箱中保存,备用。另一部分组织样品切成小块后用4%(质量分数)多聚甲醛溶液固定带回实验室,4 ℃保存备用。
1.2.2 牦牛卵母细胞的采集及体外培养 牦牛卵母细胞体外成熟:从青海省西宁市乐家湾屠宰场采集发情期牦牛的卵巢,将采集的卵巢置于约35 ℃含双抗(青霉素和链霉素)的生理盐水中,4 h 内带回实验室,将带回实验室的牦牛卵巢用加入链霉素与青霉素的37 ℃生理盐水冲洗3次,用10 mL注射器将每个卵巢表面2~8 mm卵泡中的卵泡液抽取到盛有采卵液[D-PBS+5%(质量分数)FBS]的10 mL离心管中混匀;然后,将采卵液倒入培养皿中,置于体视显微镜下,采卵针将采到的卵母细胞放入盛有采卵液的培养皿中清洗3次;再放入成熟培养液[TCM-199+10%(质量分数)FBS+100 μg/mL FSH+50 μg/mL LH+100 μg/mL E2+100 μg/mL青霉素+100 μg/mL 链霉素]中,在37 ℃ 5%(体积分数)CO2和饱和湿度下培养,24 h后以卵母细胞周围出现卵丘细胞并伴有第一极体的出现作为成熟标志。
牦牛卵母细胞孤雌激活:将成熟后的卵母细胞用D-PBS清洗3次后,移入1 g/L的透明质酸酶液体中反复轻微吹打几分钟,使其脱去周围的颗粒细胞。然后,在含有胎牛血清的D-PBS中清洗3次。挑选成熟的卵母细胞,将其转移到离子霉素(5 μmol)微滴液中激活5 min。然后,在基础培养液(TCM199)中清洗3次。再将其移入6-DMAP(2 mmol)微滴液中4 h,完成激活。将激活后的卵母细胞放入含1% BSA的SoFaa培养液中(每100 μL的微滴含有20个卵母细胞),在37 ℃ 5%(体积分数)CO2和饱和湿度下培养,分别在48、72、96、120、144和168 h时收集不同时期的胚胎,包括2~4细胞、8细胞、桑椹胚和囊胚。
1.3 qRT-PCR检测IL-1β和IL1R1 mRNA在组织和胚胎中的表达
1.3.1 总RNA提取 分别参照Total RNA KitⅠ(Omega,美国)和MicroElute Total RNA Kit(Omega,美国)RNA提取试剂盒说明,提取不同时期雌牦牛主要生殖器官和胚胎的总RNA,并参照反转录试剂盒说明合成cDNA。
1.3.2 qRT-PCR 根据GenBank公布的牛的 IL1-β和 IL1R1 mRNA序列设计引物,其具体信息和反应条件见表1。反应体系为1 μL cDNA(500 ng/μL),上下游引物各1 μL(0.2 μmol/mL),2×SYBR GreenⅡ PCR mix 10 μL,Passive Reference DyeⅡ 0.4 μL,ddH2O 6.6 μL,总反应体系为20 μL。具体反应条件:95 ℃预变性10 s;95 ℃变性10 s、退火10 s(具体温度见表1)、72 ℃延伸10 s,共40个循环,所用实时荧光定量PCR仪为applied biosystems QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System。内参基因为GAPDH,重复次数n=3。根据熔解曲线判断反应特异性,获得每个样品的Ct(cycle threshold,循环阈值)值,采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。
表1 qRT-PCR 引物信息Table 1 Information of primers used in qRT-PCR
1.4 Western-blot检测IL-1β和IL1R1蛋白在组织中的表达
1.4.1 蛋白质样品制备 取不同时期牦牛卵巢、输卵管和子宫组织样品各0.1 g,分别加入等量的组织均质缓冲液(1 mL RIPA+10 μL PMSF),冰浴振荡2 h,然后4 ℃ 12 000 g离心5 min,取上清液,并取90 μL,加30 μL溴酚蓝混匀,100 ℃煮10 min,后冰上冷却5 min,制成变性蛋白,-20 ℃保存,备用。
1.4.2 Western-blot检测 先进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE) 电泳, 5%浓缩胶(体积分数)和10%(体积分数)分离胶;电泳结束后根据目的蛋白大小对照Marker 条带切胶,选择湿法将凝胶上的蛋白转印到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上;用磷酸缓冲盐溶液-吐温(PBS+tween 20, PBST)洗 3 次,每次 10 min;用5%(质量分数)脱脂奶粉置于摇床上室温封闭95 min;分别加一抗(1∶100稀释)4 ℃孵育过夜,取出后用 PBST 洗 3 次,每次10 min;加二抗(1∶1 000稀释)于摇床上室温孵育90 min;用 PBST洗3次,每次 10 min;最后用电化学发光(electro-chemi-luminescence, ECL)避光显色,X 光片显影、定影,扫描蛋白印迹条带。每组蛋白重复3次,Image J软件分析扫描的蛋白印迹条带,根据测得的灰度值分析蛋白表达情况(蛋白表达量=目的灰度数值/内参灰度数值)。
1.5 免疫组织化学检测 IL-1β和IL1R1蛋白在组织中的分布
组织固定完全后,梯度酒精脱水,石蜡包埋,切片厚4 μm。切片常规脱蜡至水,在 pH=6的0.01 mol/L柠檬酸缓冲液中进行热诱导的微波抗原修复,煮沸 5 min,然后维持 8 min,室温下自然冷却;滴加φ=3% H2O2(SP 试剂盒),37 ℃作用 10 min,用以阻断内源性过氧化物酶活性;滴加封闭液(SP 试剂盒A 液),37 ℃湿盒孵育 15 min,勿洗只需吸去多余血清,用以减少非特异性背景;滴加一抗(1∶400 稀释),37 ℃湿盒孵育 2 h,阴性对照用 0.02 mol/L PBS 代替一抗;滴加生物素标记的二抗(SP试剂盒B 液),37 ℃下孵育 15 min;滴加 SP 试剂盒中 C 液,湿盒中 37 ℃下孵育15 min;加DAB 显色液(Invitrogen Zymed,美国),进行免疫组织化学显色。苏木精复染、梯度酒精脱水、透明、封片,晾干后置于显微镜(DP71,Olympus,日本)下拍照。
1.6 数据分析
采用SPSS 19.0对 IL-1β、 IL1R1基因与蛋白的相对表达量进行单因素方差分析,每组至少重复3次,P<0.05表示差异显著,所有结果以“平均值±标准误”表示。用Graphpad prism 7绘图。
2 结果与分析
2.1 IL-1β和IL1R1 mRNA在组织和胚胎中的表达
经扩增效率曲线、熔解曲线分析 IL-1β、 IL1R1及内参基因GAPDH分别在81.5、84.6和84.2 ℃出现单一产物峰,均与设计的引物预期产物温度接近,证明引物扩增正常特异性良好。
通过qRT-PCR结果分析发现 IL-1β和 IL1R1基因在雌牦牛卵泡期、黄体期和妊娠期中的输卵管、卵巢和子宫中均有表达(图1)。其中,卵泡期输卵管 IL-1β和 IL1R1基因的相对表达量均显著高于其他2期(图1-A、图1-D)。卵泡期和妊娠期卵巢 IL-1β和 IL1R1基因的相对表达量均显著高于黄体期(图1-B和图1-E)。卵泡期和妊娠期子宫 IL-1β基因的相对表达量均显著高于黄体期(图1-C),卵泡期、妊娠期子宫 IL1R1基因的相对表达量显著高于黄体期(图1-F)。表明 IL-1β和 IL1R1在不同时期雌性牦牛主要生殖器官中存在表达差异。
不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同 Different lowercase letter mean significantly different(P<0.05),the same below
qRT-PCR结果显示(图2) IL-1β和 IL1R1在胚胎发育过程中,2~4细胞、8细胞、桑椹胚和囊胚中均有表达。其中8细胞和桑椹胚时期 IL-1β基因的相对表达量均显著高于2~4细胞和囊胚时期(图2-A)。桑椹胚时期 IL1R1基因的相对表达量均显著高于2~4细胞、8细胞和囊胚期(图2-B)。结果表明 IL-1β和 IL1R1基因在孤雌激活胚胎早期发育过程中存在表达差异。
2.2 IL-1β和IL1R1蛋白在组织中的表达
Western-blot曝光图扫描结果显示(图3),IL-1β、IL1R1和β-actin蛋白在雌牦牛卵泡期、黄体期和妊娠期的输卵管、卵巢和子宫中均有表达。且蛋白大小与抗体参考说明一致,β-actin为 42 ku,IL1R1为 63 ku,IL-1β为30 ku和17 ku。
Western-blot结果分析显示,卵泡期输卵管和卵巢17 ku IL-1β蛋白表达显著高于黄体期和妊娠期(图4-A和图4-B)。妊娠期子宫17 ku IL-1β蛋白表达显著高于其他2期(图4-C)。
Western-blot结果分析显示,卵泡期输卵管和卵巢30 ku IL-1β蛋白表达显著高于黄体期和妊娠期(图5-A和图5-B)。妊娠期子宫30 ku IL-1β蛋白表达显著高于其他2期(图5-C)。
图2 IL-1β和 IL1R1在不同时期胚胎中的相对表达水平Fig.2 Relative expression level of IL-1β and IL1R1 at different embryonic stages
1~3.卵泡期输卵管、卵巢、子宫 Fallopian tubes, ovaries and uterus in follicular phase;4~6.黄体期输卵管、卵巢、子宫 Fallopian tubes, ovaries and uterus in luteal phase;7~9.妊娠期输卵管、卵巢、子宫 Fallopian tubes, ovaries and uterus in pregnancy
Western-blot结果分析显示,黄体期输卵管IL1R1蛋白表达显著高于卵泡期和妊娠期(图6-A)。卵泡期卵巢IL1R1蛋白表达显著高于黄体期和妊娠期(图6-B)。妊娠期子宫IL1R1蛋白表达显著高于卵泡期和黄体期(图6-C)。
2.3 IL-1β和IL1R1蛋白在组织中的分布
免疫组织化学染色可见阳性产物呈棕褐色,表示有该蛋白的分布。免疫组织化学试验结果显示(图7),IL-1β和IL1R1蛋白在卵泡期、黄体期和妊娠期的输卵管、卵巢和子宫组织切片中均有阳性表达。输卵管表达部位为黏膜上皮,卵巢表达部位为颗粒层和黄体细胞,子宫表达部位为子宫内膜和子宫腺,IL-1β和IL1R1分布部位相同。
3 讨 论
本研究发现,IL-1β和 IL1R1在卵泡期、黄体期、妊娠期的输卵管、卵巢、子宫和体外培养的孤雌激活胚胎中均有表达,证明在正常生理条件下 IL-1β和 IL1R1广泛表达于母牦牛不同繁殖周期的各个主要生殖器官中。
3.1 IL-1β和 IL1R1在输卵管中的表达
卵泡期输卵管中 IL-1β和 IL1R1基因表达均高于黄体期与妊娠期,按照牦牛繁殖周期划分顺序卵泡期、黄体期、妊娠期中 IL-1β和 IL1R1基因表达依次递减,推测可能与输卵管的生理活动有关,卵泡期卵巢产生的雌激素增加,引起输卵管内膜细胞和微绒毛增长,输卵管活动增强。IL-1β蛋白与基因表达基本一致,而 IL1R1基因与蛋白表达不一致,IL1R1的差异表达可能是通过局部反调节机制来缓和和缓冲IL1的过度效应[28]。免疫组化结果显示IL-1β和 IL1R1表达于输卵管粘膜上皮细胞,粘膜上皮细胞具有分泌功能,报道称输卵管分泌的活性物质为胚胎早期发育提供了一个维持和增强受精的环境[29-30], IL-1β和 IL1R1在输卵管中的表达结果与前人研究一致[31]IL-1系统在输卵管中的表达具有持续性,并且输卵管中IL-1的表达可能在早期胚胎植入过程中胚胎-母体间的相互作用中发挥着至关重要的作用,因此推测 IL-1β和IL1R1在牦牛输卵管中的表达也具有此作用。
图4 IL-1β蛋白(17 ku)在不同组织中的相对表达水平Fig.4 Relative expression levels of IL-1β(17 ku)protein in different tissues
图5 IL-1β蛋白(30 ku)在不同组织中的相对表达水平Fig.5 Relative expression levels of IL-1β(30 ku)protein in different tissues
3.2 IL-1β和IL1R1在卵巢中的表达
卵泡期卵巢和妊娠期卵巢中 IL-1β和 IL1R1表达高于黄体期,免疫组化结果显示IL-1β和IL1R1在卵泡颗粒细胞胞质、妊娠期黄体细胞有表达。卵泡期卵巢受FSH的影响卵泡明显增长,并且产生的雌激素增加,排卵和分泌各种激素为受精做准备。妊娠期卵巢上一直存在黄体维持妊娠,并且会有卵泡发育,卵巢生理活动增强。卵巢具有众多功能,包括提供能受精的卵母细胞和分泌生殖激素以及维持雌性动物发情周期。卵巢功能直接影响着雌性动物的繁殖能力[32]。每个发情周期过程中,卵巢都会经历增殖、侵袭、分化和细胞凋亡;这些正常的生理变化直接影响和决定了雌性动物的排卵、受精率和产仔数[33]。前人研究发现IL-1能够诱导排卵。在大鼠中,IL-1通过提高卵母细胞的排卵率来增强LH的诱发性排卵效果[34-35]。并且这一发现在母马上得到证实[36]。相反,使用IL1R1[37]、卵巢注射[38]或卵泡内注射时能降低排卵率或延迟排卵排卵时间。这些研究已经证实IL-1参与排卵,并且这种效应是由特异性受体介导的。综上所述, IL-1β和 IL1R1在牦牛卵巢的表达可能与牦牛卵母细胞的成熟、排卵和早期胚胎发育有关。
图6 IL1R1蛋白(63 ku)在不同组织中的相对表达水平Fig.6 Relative expression levels of IL1R1(63 ku)protein in different tissues
3.3 IL-1β和IL1R1在子宫中的表达
妊娠期子宫中 IL-1β和 IL1R1基因和蛋白的表达均高于卵泡期和黄体期。免疫组化结果显示 IL-1β和 IL1R1在子宫上皮细胞及子宫腺中表达。子宫作为动物胎儿或幼体发育生长的场所,在整个动物繁殖过程中扮演着重要的角色,整个妊娠期中子宫为胎儿提供发育的环境,并且提供胎儿发育所需的各种营养物质。本研究中IL-1β和 IL1R1在子宫上皮细胞及子宫腺中分布这与前人报道 IL1R1在妊娠前期猪子宫腺上皮细胞中[12,39]和牛子宫内膜中检测到[15]一致。IL-1β强表达于牛子宫内膜,在基质中较弱[40]并且推测IL-1β可能在牛子宫内膜中以旁分泌/自分泌的方式起作用,这种结果在猪上也有发现[41]。前人报道IL1系统可能参与胚胎在牛[11]和猪子宫环境中胚胎营养状况的改善[42]。因此推测 IL-1β和 IL1R1在牦牛子宫中的表达也可能参与妊娠的建立及胎儿的发育,相关机制有待进一步探究。
3.4 IL-1β和IL1R1在孤雌激活胚胎中的表达
牦牛孤雌激活胚胎中 IL-1β在桑椹胚时期最高,8细胞次之,而在2细胞和囊胚时期最低, IL1R1表达结果与 IL-1β基本一致。在2细胞时期表达最低可能与母源物质的影响有关,随着胚胎的发育,母源物质逐渐下降,胚胎基因组激活后,转录表达开始,胚胎的发育逐渐由自身合成的物质来调控,其代谢活动逐步由母源的mRNA向合子本身的mRNA控制过度,这一过程即使发育由母源向胚胎调控转变[43]。本研究发现 IL-1β在8细胞有较高分泌水平,与前人报道在人和猪上 IL-1β由植入前囊胚分泌[19]的结果不一致,可能是由于物种差异。相关报道称胚胎培养基中的IL1浓度与体外受精和胚胎移植后成功植入呈正相关[22,25]与早期妊娠有相关性。
A~I.免疫组织化学染色图片 A-I are immunohistochemical staining photos;其中A、B、C、D、E为阳性表达 A,B,C,D,E are positive expression,F、G、H、I为阴性对照 G,H,I are negative control;A、F为输卵管 Fallopian tube,B、E、G为卵巢 Ovary,C、D、H、I为子宫 Uterus;EM:黏膜上皮 Mucosal epithelium;SG.颗粒层 Stratum granulosum;EP.子宫内膜 Epithelium mucosae;UG.子宫腺 Uterine glands;CL.黄体细胞 Corpus luteum verum
4 结 论
本试验在雌牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中对 IL-1β和 IL1R1的表达进行定位分析。研究发现 IL-1β和 IL1R1在雌性牦牛不同时期的生殖器官和孤雌激活胚胎中均有表达并且存在差异,表明 IL-1β和 IL1R1在牦牛生殖过程中具有重要的生物学作用,推测其可能参与牦牛卵母细胞成熟、排卵、早期胚胎和妊娠期胎儿的发育,相关机制有待进一步研究。