接骨木镰刀菌产孢培养基筛选

杨 波，郭成瑾，王喜刚，沈瑞清,

(1.宁夏大学 农学院，银川 750021；2.宁夏农林科学院 植物保护研究所，银川 750002)

镰刀菌属(Fusarium)真菌是一类分布极其广泛的真菌[1]，其中的许多种都能严重危害经济作物。通过寄生植物维管束系统，损坏输导组织，产生某些毒素，可造成作物重大损失，严重时颗粒无收[2]。如尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)可在油桐、西瓜、黄瓜等作物上引起一种毁灭性病害——枯萎病[3-5]；禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)可侵染小麦引起赤霉病[6-7]；燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)、尖孢镰刀菌均可引起大蒜干腐病[8-9]；茄病镰刀菌(Fusariumsolani)、尖孢镰刀菌等引起甘薯烂根病[10]；接骨木镰刀菌(Fusariumsambucinum)、茄病镰刀菌和锐顶镰刀菌(Fusariumacuminatum)等是引起甘肃、黑龙江、内蒙古等地马铃薯干腐病的主要致病菌[11-13]。

接骨木镰刀菌作为一种致病镰刀菌，据有关报道，它不仅是引起国内外马铃薯病害的主要病原菌[14-15]，而且是中国甘肃[12]、河北、内蒙古[13]、黑龙江[11]及新疆[16]多个马铃薯主产区的优势病原菌，造成严重的经济损失。接骨木镰刀菌在已知培养基上产孢量不大，因此，一种能够促进接骨木镰刀菌产生大量孢子的培养基在致病性等相关研究中至关重要。在筛选促进镰刀菌产孢培养基的研究上，中国学者做了大量研究。李健等[17]研究结果表明，以狗尾草玉米淀粉培养基进行镰刀菌培养，在菌落生长和分生孢子产孢量方面都显著优于其他杂草培养基和日常真菌培养基；在对串珠镰刀菌产孢培养基的研究中，中国学者研究表明，蚕豆叶培养基能够促进串珠镰刀菌产生大量的分生孢子[18]。有研究认为镰刀菌属许多种的分离菌株往往有产生丰富菌丝的趋势而不形成孢子，接骨木镰刀菌虽然能够产生孢子，但其在PDA培养基上的产孢量往往达不到配制特定浓度孢子悬浮液的要求，且一般情况下接骨木镰刀菌在合成培养基上生长时，生长和产孢能力都有一定程度的退化，理想的培养基仍然有待开发[1]。

本试验选取8种常用镰刀菌培养基[18-20]，通过菌落生长量和产孢量的测定，从中选出几种较好的培养基，然后自配5种新的培养基观察接骨木镰刀菌的生长量和产孢量，筛选最佳培养基，为以后研究接骨木镰刀菌提供一种理想培养基，方便科研工作者在研究中配制特定浓度的孢子悬浮液。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株：N-34-1号菌株(2017年从采自宁夏西吉县马铃薯‘青署9号’病薯上分离得到)，经形态学和分子学鉴定为接骨木镰刀菌(Fusariumsambucinum)，现保存于宁夏农林科学院植物保护研究所实验室。

常用培养基[19-21]：PSA培养基，VBC培养基，CMC培养基，麦粒培养基，CMA培养基，燕麦培养基，马铃薯牛肉膏培养基，PDA培养基。

自配培养基：WOA培养基，WLA培养基，OLA培养基，OSA培养基，LSA培养基(自配培养基配方见表1)。

表1 自配培养基的配方Table 1 The formulation of self-made media

1.2 试验方法

1.2.1 培养基对接骨木镰刀菌菌落生长的影响 培养基配制好后分装于250 mL的三角瓶中，每瓶装100 mL，湿热灭菌锅121 ℃下灭菌30 min后，倒入直径8 cm的培养皿中，每种培养基倒3皿，每皿接入接骨木镰刀菌的菌饼1块(直径5 mm)，放入恒温培养箱中25.5 ℃恒温培养，采用十字交叉法测量不同培养基培养不同时间的菌落直径。

1.2.2 培养基对接骨木镰刀菌产孢量的影响 培养基配制好后，分装于250 mL的三角瓶中，每瓶装100 mL，湿热灭菌锅121 ℃下灭菌30 min后，倒入直径8 cm的培养皿中，每种培养基倒3皿，每皿接入接骨木镰刀菌的菌饼1块(直径5 mm)，放入恒温培养箱中25.5 ℃恒温培养，分别在培养1、3、5、7、9 d时用直径为 5 mm 的打孔器在菌落上打菌饼，置于1 mL无菌水中制成孢子悬浮液，用血球计数板在显微镜下观测孢子数。

1.2.3 自配培养基的混配方法 根据8种常用培养基菌落生长和产孢量的试验结果，从中筛选出菌落生长快、产孢量大的培养基，将其进行两两减半自配，自配出5种新的培养基，依次命名为WOA、WLA、OLA、OSA和LSA培养基，再对5种自配培养基进行接骨木镰刀菌生长量的测定。

1.3 数据处理

所有数据均采用Excel 2000 软件进行整理，并通过SAS 8.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 常用培养基对接骨木镰刀菌生长的影响

2.1.1 菌落生长 由表2可以看出，8种常用培养基对接骨木镰刀菌菌落生长有一定影响。从测量的第2天开始菌落直径逐渐变大，当培养至第8天时菌落直径均达到最大值。其中PSA培养基上的菌落直径增长最快，培养至第4天时PSA培养基上的菌落直径为5.09 cm，比PDA培养基上菌落直径增加22.40%；第8天时PSA培养基上接骨木镰刀菌的菌落直径比最小的PDA培养基增加26.84%。差异显著性分析表明，培养到 4～8 d 时，PSA培养基上接骨木镰刀菌的菌落直径和其他7种培养基之间差异显著。总体来看，综合考虑菌落生长的4个时间段，PSA培养基相对于其他培养基接骨木镰刀菌菌落生长最明显。

表2 接骨木镰刀菌在8种常用培养基上的菌落直径Table 2 The diameter of colonies of Fusarium sambucinum on eight common used media

注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note：Different lowercases indicated significant differences(P<0.05).The same below.

2.1.2 产孢量 由表3可知，随着培养时间的增加，8种培养基上接骨木镰刀菌的孢子量总体呈现上升趋势。从第3天开始接骨木镰刀菌的孢子量逐渐开始增加，除了PDA培养基以外的其他7种培养基均在观察的第9天达到孢子量的最大值。其中麦粒培养基上的产孢量增长最快，培养至第3天时麦粒培养基上的孢子数比产孢量最少的燕麦和PSA培养基上的孢子量增加84.98%；当培养至产孢量最大的第9天时，麦粒培养基上的孢子量比PSA、VBC、CMC、CMA和PDA培养基上的孢子量分别增加64.67%、94.83%、91.36%、55.15%和89.65%。

差异显著性分析表明，当培养到第3～7天时，麦粒培养基上的孢子量与其他几种培养基之间差异显著；培养至孢子量最大的第9天时，麦粒、燕麦和马铃薯牛肉膏3种培养基之间孢子量无显著性差异，而与其余4种培养基差异显著。总体来看，在接骨木镰刀菌产孢的4个时间段内，与其他培养基相比较，麦粒培养基上产孢量的增幅最明显，其次为马铃薯牛肉膏和燕麦培养基。

表3 接骨木镰刀菌在8种常用培养基上的产孢量Table 3 Sporulation of Fusarium sambucinumon on eight common used media

2.2 自配培养基对接骨木镰刀菌生长的影响

2.2.1 菌落生长 由表4可以看出，以常用培养基PDA为对照，5种自配培养基对菌落生长有一定的促进作用，生长速度均大于PDA培养基。随着培养时间的增加，接骨木镰刀菌在6种培养基上的菌落直径也呈现递增趋势，当培养至第5天时菌落直径达到最大值。其中WLA培养基上的菌落直径增长最快，培养至1 d时，生长最快的WLA培养基比对照PDA培养基的菌落直径增加 20.83%；培养至菌落直径最大的第5天时，WLA培养基菌落直径比对照PDA培养基上菌落直径增加9.57%。差异显著性分析表明，培养到第2～4天时，WLA培养基上的菌落直径与其他5种培养基之间差异显著；培养5 d时，WLA培养基与WOA、OSA、LSA和PDA培养基之间差异显著。综上所述，5种自配培养基中WLA培养基对接骨木镰刀菌的菌落直径影响最明显，而其他4种之间差异不显著，但培养效果都优于PDA培养基。

表4 接骨木镰刀菌在5种自配培养基上的菌落直径Table 4 The colony diameter of Fusarium sambucinum grown on five self-made media and control medium(PDA)

2.2.2 产孢量 自配培养基对接骨木镰刀菌产孢量的影响见表5。结果表明，5种自配培养基和对照培养基上的产孢量随时间的延长均呈现递增的趋势。从第3天开始，各个培养基上接骨木镰刀菌的孢子量逐渐增加，在测量的第9天时孢子量达到最大值。其中孢子量增长最快的是WLA和OLA培养基，培养至第3天时，WLA和OLA培养基上的孢子量比对照PDA培养基分别增加84.53%和88.18%；第5天时产孢量最大的OLA培养基比对照PDA培养基增加88.81%；第7天时产孢量最大的WLA培养基比PDA培养基增加87.42%；当培养至第9天时，WLA培养基上接骨木镰刀菌的产孢量则明显高于其他几种培养基，WLA培养基上的孢子量比WOA、OLA、OSA、LSA和PDA培养基分别增加78.96%、34.73%、88.49%、65.87%和90.68%。差异显著性分析表明，培养到第9天时WLA培养基上的产孢量与其他5种培养基差异显著。综合考虑培养的几个阶段，从产孢量上考虑，WLA和OLA培养基对接骨木镰刀菌的产孢量具有很好的促进作用，其中最好的是WLA培养基。

3 结论与讨论

接骨木镰刀菌在不同培养基上的菌落生长和产孢量存在明显差异。试验结果表明，新配的5种培养基中WLA为培养接骨木镰刀菌的最适培养基，在菌落生长和产孢量上均优于其他几种培养基。接骨木镰刀菌是一种重要的致病镰刀菌，目前关于接骨木镰刀菌的研究主要集中在分离鉴定、拮抗菌及抑菌药剂的筛选方面。魏巍等[13]在对河北和内蒙古马铃薯干腐病菌种类鉴定中发现，接骨木镰刀菌是两省的优势种群，分离频率分别为50.00%和87.95%。王爱军等[22]和崔岩等[23]分别以萎缩芽胞杆菌(B.atrophaeus)和俄罗斯木霉(Trichodermarossicum)为研究对象，发现他们对接骨木镰刀菌均有很好的拮抗作用。杜密茹等[24]在对马铃薯镰刀菌干腐病杀菌剂防效研究中发现，好力克和世高的抑菌效果最好，对菌丝和孢子的抑制率均达100%。接骨木镰刀菌产孢培养基的筛选研究至今尚未报道，而对于镰刀菌其他种产孢培养基筛选的报道屡见不鲜，蓝江林等[25]在对尖孢镰刀菌非致病力菌株281进行培养基筛选试验中发现，在选用的8种培养基中PDA和ATCC培养基在产孢量上优于其他几种培养基。温州民等[26]则在筛选促进禾谷镰刀菌产孢培养基研究中发现，草汁琼脂培养基能够促进禾谷镰刀菌产孢。

对于真菌培养基来说，碳、氮源和矿物质是基本组成物质，其中碳源的影响最大，氮源次之。通常情况下，在含有淀粉或者纤维素的基质上，可以促进孢子形成。本试验最终得到WLA培养基对接骨木镰刀菌菌落的生长及产孢量都优于其他培养基，而WLA培养基中马铃薯和麦粒中都含有大量的淀粉。据有关研究指出当用单糖做碳源时不利于真菌在培养基上产孢，董汉松等[27]研究认为PDA培养基并不总是给予真菌最大的产孢量与生长量，PDA培养基中所含的葡萄糖为单糖，而本试验中自配培养基WLA所含麦芽糖是双糖而非单糖，这就使得自配WLA培养基在生长量和产孢量上优于其他培养基。再辅以牛肉浸膏、水及琼脂中提供的矿物质营养，对接骨木镰刀菌的生长及大量产孢提供优异的环境，并且WLA培养基的配方简单，所用原材料均易得，因此可作为培养接骨木镰刀菌的理想培养基。

本试验对接骨木镰刀菌产孢培养基进行研究，效果很明确，但针对镰刀菌属真菌大量产孢的理想培养基，仍有待于在试验和实践中去寻找，虽然本试验最终得到的WLA培养基能够促进接骨木镰刀菌的生长及大量产孢，但镰刀菌属真菌种类繁多，接骨木镰刀菌只是其中之一，本试验尚未明确用WLA培养基培养镰刀菌属真菌的其他种是否有像接骨木镰刀菌一样的培养效果，因此有待进一步的试验与研究。