紫花苜蓿 MsUGT73B2基因的克隆及表达

2018-11-29任鹏辉杨培志呼天明

西北农业学报 2018年10期

尤章，张靖，任鹏辉，杨培志，呼天明

(西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100)

作为植物体最为重要的反应之一，糖基化修饰与植物蛋白或小分子物质的生物活性、溶解性、稳定性等生物学特性密切相关。在天然产物的生物合成、植物体激素平衡、植物体防御反应、亚细胞定位、外来化合物的生物脱毒及生物活性物质在液泡中储存等方面具有重要作用。自然界中大多数的糖基化反应由糖基转移酶介导，其由一个大的、发散的多基因家族构成[1]。糖基转移酶被划分为94个家族，其中家族1是最大的家族，并与植物的功能密切相关[2]。家族1的糖基转移酶(UGT)都具有一个被称为“植物次级产物糖基转移酶盒”(PSPG BOX)的羧基末端共有序列，并以尿苷5′-二磷酸糖作为糖供体，因此被命名为UDP-葡糖基转移酶(UGT)[3-5]。UGT的重组表达研究结果显示其可以催化产生多种植物次级代谢产物，如糖苷、萜类、生物碱、酚类等。植物生长发育过程中许多生物过程需要UGT进行糖基化，特别是调控植物次生代谢[6-7]和植物体激素平衡[8]。糖基转移酶不仅在植物糖基化过程中发挥作用，而且参与植物体对逆境的多种响应。拟南芥(Arabidopsis thaliana)家族1 UGT的一个子集已经得到功能性鉴定，其中一些参与逆境的适应。拟南芥AtUGT76B1(AT3G11340)在结合异亮氨酸方面起作用，它参与防御病原体感染[9]。AtUGT74E2(AT1G05680)以吲哚丁酸(IBA)作为基质，与水分胁迫抵抗有关[10]。另外，拟南芥AtUGT85A5(AT1G22370)在烟草(Nicotianatabacum)中的异源表达大大提高其对盐胁迫的适应性[11]。蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula) GT99D基因参与合成花青素、黄酮类物质，可能参与逆境环境的响应[12]。

豆科植物体内黄酮、类黄酮类物质含量丰富。黄酮类天然产物在植物防御、共生、发育和授粉方面具有广泛的活性[13-16]。黄酮类物质对于人类健康亦具有重要作用，包括预防心血管疾病和癌症等[17]。黄酮类化合物和异黄酮类化合物在自然界中通常被发现为糖缀合物，其中糖基残基可能对生物活性至关重要。糖基化作为植物体多种代谢物合成、修饰与运输的最后一步，对于植物体生长发育至关重要，而糖基转移酶作为糖基化的催化剂，对于底物糖基化尤为关键。紫花苜蓿(Medicagosativa)为豆科苜蓿属植物，具有重要的饲用价值，在草牧业发展中具有重要作用[18]，对其糖基转移酶的研究鲜见报道。

本研究利用RACE-PCR技术克隆紫花苜蓿糖基转移酶 MsUGT73B2基因，利用生物信息学、qRT-PCR等方法对其进行分析，为进一步研究紫花苜蓿糖基转移酶基因功能，鉴定其是否在植物逆境胁迫中发挥重要作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以紫花苜蓿(MedicagosativaL.cv.Baoding)、本氏烟草(Nicotianabenthamiana)为试验材料，均由西北农林科技大学草业科学系保存。

1.2 RNA提取和cDNA的反转录

以2周龄紫花苜蓿全株为提取RNA的材料，使用RNA提取试剂盒(TaKaRa)提取紫花苜蓿RNA，试验步骤参照试剂盒说明书。利用第一链cDNA合成试剂盒(TaKaRa)进行反转录，获得紫花苜蓿cDNA模板，-20 ℃保存，备用。

1.3 紫花苜蓿 MsUGT73B2基因中间片段的克隆

根据NCBI数据库中蒺藜苜蓿 MtGT99D基因序列，利用Primer 5.0软件设计中间片段的上下游特异引物F-UGT、R-UGT(表1)，引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。使用55 ℃退火温度进行PCR扩增，产物经胶回收后连接至pMD-19T(Simple)载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板培养，挑取阳性克隆，菌检后送上海生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果用Blast分析，筛选目的序列。

表1 中间片段引物Table 1 Primer of middle fragment

1.3 紫花苜蓿 MsUGT73B2基因中间片段的克隆

以“1.3”测序结果为模板，设计3′和5′末端扩增特异性引物3′GSP、5′GSP(表2)并合成。根据SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clonetech)试剂盒说明书，使用72 ℃退火温度进行3′和5′末端扩增，产物胶回收后进行克隆及测序，得到紫花苜蓿 MsUGT73B2基因全长序列，设计基因全长引物35S-UGT-F、UGT-EGFP-R(表2)，扩增基因全长片段。

表2 GSP和基因全长引物序列Table 2 Primer sequence of GSP and full-length gene

注：下划线碱基表示EcoRⅠ酶切位点，斜体的碱基为15 bp同源序列，用于同源重组克隆。

Note:Underlined bases representEcoRⅠ restriction sites, and the italicized bases represent 15 bp homologous sequences for homologous recombination cloning.

1.5 生物信息学分析

利用DNAMAN 6.0进行氨基酸序列同源比对，并构建系统发育树；利用在线软件ExPASY(https://www.expasy.org/)对基因编码蛋白进行氨基酸序列分析，预测信号肽、二级结构、亲疏水性等；利用SWISS-MODEL软件(https://www.swissmodel.expasy.org/interactive)分析蛋白三级结构，利用Wolf Psort软件(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)进行亚细胞定位预测分析。

1.6 紫花苜蓿 MsUGT73B2基因表达分析

根据测序得到的紫花苜蓿 MsUGT73B2基因全长序列，利用IDT网站(https://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index)设计实时定量PCR(RT-qPCR)引物(表3)。以数据库紫花苜蓿β-ActincDNA为内参基因[19]，使用EvaGreen 2× qPCR MasterMix -No Dye试剂盒(ABM)，每个样品3个重复，反应体系20 μL：10 μL qPCR MasterMix，正反向引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL；对水培30 d的紫花苜蓿 MsUGT73B2基因在干旱、10 μmol/L ABA、150 mmol/L NaCl处理下地上、地下部分的相对表达量进行检测。采用2-ΔΔCt法分析基因mRNA的相对表达量。

表3 RT-qPCR引物序列Table 3 Primer sequence of RT-qPCR

1.7 基因表达载体构建与亚细胞定位

将“1.4”得到的基因全长片段与EcoRⅠ切开的pCAMBIA1300-35S-EGFP载体使用同源重组酶构建重组载体pCAMBIA1300-35S-MsUGT73B2-EGFP，重组载体转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆菌检后测序，阳性克隆提取质粒转化农杆菌GV3101，通过侵染烟草叶片观察亚细胞定位。

1.8 数据分析

使用SPSS 17.0进行数据统计分析，使用Microsoft Excel 2016软件作图。

2 结果与分析

2.1 MsUGT73B2基因的克隆

以紫花苜蓿cDNA为模板，使用正反向引物F-UGT、R-UGT扩增得到长度968 bp的中间片段序列(图1)，测序后经NCBI序列比对，发现其与蒺藜苜蓿 A17MtGT99D 基因具有较高相似性，证明扩增得到的紫花苜蓿基因序列可用。以3′GSP、5′GSP为引物扩增得到长度分别为821和1 186 bp的3′与5′端序列并进行拼接，得到基因全长序列(图1)。利用全长引物35S-UGT-F和UGT-EGFP-R扩增得到长度为1 512 bp的基因全长序列(图1)。最终扩增得到的基因全长序列与蒺藜苜蓿 A17MtGT99D基因相似性较高，表明所得序列是紫花苜蓿 MsUGT73B2基因序列。

由生物信息学分析可知，该基因编码区长度为1 512 bp，编码503个氨基酸(aa)，包括碱性氨基酸58个，酸性氨基酸73个；疏水氨基酸223个和极性氨基酸280个(图2)。

图1 MsUGT73B2基因扩增电泳检测Fig.1 Electrophoresis pattern of MsUGT73B2 amplification

2.2 MsUGT73B2蛋白同源序列分析

紫花苜蓿MsUGT73B2蛋白序列与拟南芥、木豆、大豆、蒺藜苜蓿、葛根、地三叶、绿豆的UGT氨基酸序列同源比对结果如图3所示，深蓝色表示完全比对，即非常保守，其余颜色表示相对比较保守序列，未用颜色标记序列表示差异序列，显示出不同的物种差异性。黑线表示PSPG BOX，PSPG BOX的起始氨基酸W和终止氨基酸Q具有很高的保守性。比对结果显示，该蛋白属于糖基转移酶家族，与拟南芥相比，几种豆科植物MsUGT73B2蛋白氨基酸序列同源性更高。氨基酸C端保守性较高，此与其蛋白家族功能相关，该家族蛋白C末端具有由44个氨基酸残基组成的PSPG BOX功能结构域。氨基酸序列间具有一定的差异性，表明该蛋白在不同物种间具有序列差异性。

2.3 MsUGT73B2蛋白系统发育树的构建

紫花苜蓿MsUGT73B2蛋白与其他10种植物UGT蛋白的系统发育树结果如图4所示，紫花苜蓿 MsUGT73B2基因所编码的蛋白与蒺藜苜蓿位于同一分支，其序列同源性达93%，表明它们之间亲缘关系最近，说明选取数据库蒺藜苜蓿序列作为紫花苜蓿参考序列是可行的。豆科植物糖基转移酶之间的同源性大于70%，远高于拟南芥、野草莓、欧洲大叶杨和苹果(仅43% 左右)，表明进化过程中豆科植物间出现分歧时间较晚。

图2 MsUGT73B2基因全长CDS及编码氨基酸序列Fig.2 CDS and deduced protein sequence of MsUGT73B2

2.4 MsUGT73B2蛋白理化性质分析

对MsUGT73B2蛋白理化性质进行分析，结果显示，分子式为C2552H3954N662O747S22，理论等电点为5.36，分子质量为56.6 ku，蛋白半衰期为30 h，该蛋白不稳定系数为40.15，属于稳定性蛋白。如图5所示，在第29个氨基酸残基处取最大值2.122，在第272和273个氨基酸残基处取最小值 -3.200，总平均疏水指数为 -0.234，属于亲水性蛋白。通过TMHMM软件分析可知，MsUGT73B2蛋白不存在跨膜结构区域。利用SignalIP软件对蛋白信号肽进行预测可知，该蛋白无信号肽区域。

2.5 MsUGT73B2蛋白二级结构及三级结构预测

对MsUGT73B2蛋白二级结构预测结果如图6所示，在蛋白二级结构中，α-螺旋(Alpha helix)占 45.15%，不规则卷曲(Random coil)占36.18%，延伸链占15.90%，β-转角占5.77%；N端和C端均以α-螺旋为主。以三萜烯糖苷转移酶UGT71(PDB:2acv)为模型构造MsUGT73B2蛋白模型，MsUGT73B2蛋白与蛋白模型相似度为27.11%，同为UGT蛋白单体分子，N末端氨基酸序列由5个扭曲的β-片层和6个α-螺旋组成；C末端氨基酸序列包含6个α-螺旋与3个β-片层；第357位为色氨酸残基，第400位为谷氨酰胺残基，中间部分为PSPG BOX区域；C端与N端由一个柔性环连接，形成一个松散可变的深沟。

2.6 紫花苜蓿 MsUGT73B2基因表达分析

MsUGT73B2基因在紫花苜蓿根部和叶片中均有表达。 MsUGT73B2基因在叶片中的表达量显著高于根部，为根部的5.85倍(P<0.05)(图7)。干旱胁迫下，叶片中该基因的表达呈先升高后降低的趋势，在2 h时达到最高值(上升67%)，后开始下降(4 h时，表达量低于0 h)；根部在干旱2 h时总体呈下降趋势(图8)。ABA处理下，该基因的表达模式与干旱表现出相似的趋势，即叶片中表达量先升高后降低，在2 h时达到最高值，随叶片中时间延长基因表达量持续降低；根部在2～4 h表达量略高于对照(0 h)，但并未出现显著差异，4 h后基因表达水平显著降低(图9)。盐处理时，在4 h之前叶片中基因的表达量显著增加，4 h后快速下降，8 h时与对照相比降低70%；根部基因表达量在盐处理下随时间的延长持续降低，且在盐胁迫初期具有显著变化(图10)。

图3 UGT 家族氨基酸序列多重比对Fig.3 Multiple sequence alignment of UGT gene family

图4 UGT基因系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree construction of UGT gene

图5 蛋白亲疏水性分析Fig.5 Distribution curve of hydropathy of protein

蓝色为α-螺旋 Blue is alpha helix；红色为延伸链 Red is extended strand；绿色为β-转角 Green is beta turn；紫色为不规则卷曲 Purple is random coil

*表示差异显著(P<0.05) * significantly different at level of P<0.05.

不同小写字母表示紫花苜蓿同一部位不同处理时间的差异(P<0.05)。下同。

2.7 基因表达载体构建与蛋白亚细胞定位

MsUGT73B2蛋白亚细胞定位预测结果表明，由于不存在各种细胞器定位信号，预测该蛋白可能定位在细胞质中。将pCAMBIA1300-35S-MsUGT73B2-EGFP表达载体注射烟草叶片进行亚细胞定位，结果如图11所示，MsUGT73B2蛋白定位在细胞质中，与预测结果一致，表明 MsUGT73B2基因编码的糖基转移酶在细胞质中进行底物的糖基化。

图9 MsUGT73B2基因对ABA处理的响应Fig.9 Response of MsUGT73B2 gene to ABA treatment

图10 MsUGT73B2基因对盐胁迫的响应Fig.10 Response of MsUGT73B2 gene to salt stress

图11 MsUGT73B2基因亚细胞定位Fig.11 Subcellular localization of MsUGT73B2 Gene

3 讨论

植物糖基转移酶在植物体代谢中发挥重要作用，紫花苜蓿糖基转移酶对于其次生代谢调控、生长发育及逆境响应具有重要意义。本研究通过序列比对发现，糖基转移酶C端相比于N端更保守。糖基转移酶C端负责识别和结合糖基供体，N端负责识别与结合糖基受体[20]。C端PSPG BOX含有10个高度保守的氨基酸，可能与其UDP-糖的结合有关[21]。PSPG BOX的第一个氨基酸残基W与最后一个氨基酸残基Q具有高度保守性，W与UDP-糖基的结合相关[22]，Q则更利于结合葡萄糖苷[23]，因此MsUGT73B2蛋白更倾向于结合UDP-葡萄糖进行转移。系统发育树显示，与拟南芥UGT73B2蛋白相似，具有UDP-葡糖基转移酶活性、UDP-糖基转移酶活性、黄酮醇3-O-葡糖基转移酶活性、黄酮醇7-O-β-葡糖基转移酶活性、槲皮素3-O-葡糖基转移酶活性、槲皮素7-O-葡糖基转移酶活性[24]。哺乳动物糖基转移酶通常含有信号序列，可以进入内质网，并具有跨膜结构域和内质网滞留信号KEDL或HEDL，因此通常定位于内质网中[25]。通过对拟南芥糖基转移酶分析，发现植物糖基转移酶与哺乳动物定位不同，其糖基转移酶定位于细胞质[26]，属于一类细胞质酶。对该蛋白进行理化性质分析结果显示其属于不稳定的亲水性蛋白分子，无信号肽与跨膜结构，与其定位于细胞质中相吻合。植物糖基转移酶功能复杂，序列差异性较大，但其三维结构和反应机制并未发生巨大变化，因此通过同源建模可以有效地了解糖基转移酶的三维结构[27]。同源建模结果显示，MsUGT73B2蛋白属于典型的GT-B构象，此与梭梭(Haloxylonammodendron)和刺五加(Eleutherococcussenticosus)UGT蛋白相似，都属于GT-B构像蛋白[28-29]。GT-B构象为两个正对的 β/α/β类Rossmann折叠区域，不需要二价金属离子作为辅基保持活性[21]。

对 MsUGT73B2基因进行荧光定量RT-qPCR检测，它主要在紫花苜蓿叶片中进行表达，此与蒺藜苜蓿 MtGT99D基因报道相符[30]。对 MsUGT73B2基因在干旱、盐和ABA处理下进行基因表达分析，结果表明处理前期该基因在叶片中的表达呈上升趋势，随胁迫时间延长基因表达量逐渐降低，可在胁迫早期增加该基因的表达水平提高紫花苜蓿对于胁迫的响应能力。拟南芥中过表达 UGT73B2基因可以增强其对活性氧的抗性[31]。紫花苜蓿 MsUGT73B2基因是否在植物逆境胁迫中具有重要作用有待进一步验证。