高强度聚焦超声联合竹红菌素软膏对外阴上皮非瘤样病变组织中P16、CD34的影响*

张宪军，陈志红，李明，李桂芬，宋永祯

（河北省衡水市人民医院 1.妇科，2.内科，河北 衡水 053000）

女性外阴处皮肤出现异常色素沉淀或黏膜组织变性被称为外阴上皮内非瘤样病变（non neoplastic intraepithelial lesions of vulva, NNED）[1]。 目前，对NNED的发病机制尚无明确的认知，可能与患者局部微循环缺陷、细胞周期异常有关[2]。高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound, HIFU）是近年来发展起来的一种新型无创NNED治疗手段，具有操作简单，对机体几乎无创伤，疗效显著等特点[3-4]。竹红菌素软膏是一种涂抹于外阴处皮肤的外用药物，具有抑菌作用[5]。临床研究认为，两者联合运用对NNED的治疗具有显著效果。目前，普遍认为NNED的发生与细胞周期失调和微循环障碍有关。P16蛋白是参与抑癌基因调控和细胞周期调控的关键蛋白，CD34是高特异性血管内皮标志物[6-7]。这两种蛋白在NNED的发生、发展中起到重要作用。本研究对比HIFU单独治疗和联合治疗对患者病变组织中P16和CD34蛋白表达水平的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年12月-2015年12月在该院进行治疗的80例NNED患者为研究对象。其中，2013年12月以前入院的40例患者作为对照组，选择2013年12月以后入院与其状况相似的40例患者作为观察组。对照组：年龄18～59岁，平均（43.6±4.1）岁；平均病程（4.3±0.6）年；硬化性苔藓型（lichen sclerosis, LSV）6例、鳞状上皮细胞增生型（squamous hyperplasia, SHV）30例、合并型（lichen sclerosis combined with squamous hyperplasia, LSCSH）4例。观察组：年龄20～62岁，平均（44.9±3.2）岁；平均病程（4.1±0.8）年；LSV型4例、SHV型33例、LSCSH型3例。

经检验，两组患者年龄、病程、病理分型等差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究获得医院医学伦理委员会的批准，所有患者均对研究内容知情同意并签署知情同意书。

纳入标准：①所有入选患者均接受过其他治疗，但出现复发；②年龄＜65周岁，＞18周岁；③患者治疗依从性好；④自愿参与本研究。排除标准：①病变组织进行病理学检查显示为外阴癌和不典型增生者；②经期患者；③阴道急性炎患者；④存在心脏病、糖尿病、甲亢和恶性肿瘤患者；⑤对治疗所用药物过敏者。

1.2 研究方法

所有患者均接受HIFU治疗。采用CAF型聚焦超声治疗仪（购自重庆海扶技术有限公司）进行治疗。患者首先取截石位，功率3.7 W，频率9.5 MHz，治疗范围为病变区及其外0.5 cm，速度为3～5 mm/s。探头对准目标治疗区域紧贴病变皮肤进行连续的直线扫描，控制扫描速率为2～3 mm/s，可根据患者自身病变区域大小和严重程度灵活调整治疗时间，治疗时间最少15 min，最长不得超过50 min。每3次治疗为1个疗程，每次治疗之间间隔2周，所有患者均接受2个疗程的治疗。

在此基础上，观察组患者还接受竹红菌素软膏治疗。观察组患者进行HIFU治疗时，将5 g竹红菌素软膏与超声专用传导介质耦合剂混合，并涂抹到目标治疗区域，而后进行超声治疗。

1.3 观察指标

疗效评价：参考武爱芳等[8]建立的“外阴瘙痒评分法”“四度皮肤弹性评估法”“外阴白色病变面积计算法”，对治疗前和治疗2个疗程结束后6个月患者外阴患处皮肤进行评价，以数字得分来表示患处皮肤状态，得分越低分别表示患处皮肤瘙痒程度低、皮肤富有弹性和病变面积小。

组织P16蛋白和CD34蛋白水平检测：采集所有患者治疗前病变处皮肤组织，2个疗程治疗结束后6个月随访时，采集患者相同位置处皮肤组织。同时，治疗前还需要采集所有患者病灶附近健康皮肤组织样本，作为空白组。采集得到的皮肤组织中加入蛋白裂解液提取蛋白并进行Western blot检测。采用Image J软件对所得蛋白条带的灰度值进行分析，设置空白组目的蛋白的含量为100，计算对照组和观察组目的蛋白的含量相对值。

观察治疗过程中两组患者出现不良反应的情况。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较做差值的独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 疗效评价指标比较

患者疗效评价指标比较见表1。治疗前两组患者3项得分经t检验，差异无统计学意义（P＞0.05），两组患者治疗前后3项指标得分经t检验，差异有统计学意义，治疗后3项得分均低于治疗前（P＜0.05），但组间比较显示，观察组患者治疗后3项指标得分与对照组患者之间的差异有统计学意义，观察组患者治疗后3项指标得分低于对照组患者（P＜0.05）。

2.2 病变组织P16和CD34蛋白水平比较

治疗前两组患者两种蛋白表达经t检验差异均无统计学意义（P＞0.05），两组患者治疗前后两种蛋白表达经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），治疗后两组患者P16蛋白水平高于治疗前，而CD34蛋白水平低于治疗前（P＜0.05）。但组间比较显示，观察组患者治疗后两种蛋白表达与对照组患者之间的差异有统计学意义（P＜0.05），观察组患者治疗后P16蛋白表达高于对照组患者，而CD34蛋白表达低于对照组患者。见表2。

表1 NNED患者疗效评价指标比较 （n =40，±s）

表1 NNED患者疗效评价指标比较 （n =40，±s）

外阴瘙痒评分 四度皮肤弹性评分 外阴白色病变面积/cm2治疗前 治疗后 t值 P值 治疗前 治疗后 t值 P值 治疗前 治疗后 t值 P值观察组 2.54±0.22 0.56±0.11 50.912 0.000 2.01±0.54 0.32±0.07 19.629 0.000 12.49±3.57 2.59±0.25 17.496 0.000对照组 2.55±0.25 1.02±0.23 28.485 0.00 2.07±0.36 0.91±0.05 20.185 0.000 12.35±3.32 5.68±1.02 12.146 0.000 t值 0.190 11.411 0.585 43.378 0.182 18.609 P值 0.850 0.000 0.561 0.000 0.856 0.000组别

表2 病变组织P16和CD34蛋白表达比较 （n =40，±s）

表2 病变组织P16和CD34蛋白表达比较 （n =40，±s）

CD34蛋白治疗前 治疗后 t值 P值 治疗前 治疗后 t值 P值观察组 63.29±2.94 86.30±2.40 38.345 0.000 158.39±8.94 119.32±6.04 22.903 0.000对照组 63.17±2.69 76.49±3.85 17.937 0.000 158.05±8.43 132.10±8.32 13.857 0.000 t值 0.190 13.676 0.175 7.862 P值 0.849 0.000 0.862 0.000 P16蛋白组别

2.3 治疗相关不良反应

在治疗过程中，两组患者均分别出现1例（1/40，2.5%）外阴皮肤浅表性破溃及水泡，经对症治疗后均痊愈，其余患者均未出现不良反应。

3 讨论

NNED是一种慢性顽固性病变，患者外阴真皮层出现局部微循环障碍，真皮层毛细血管闭塞，胶原蛋白生成受阻，造成真皮内细胞出现不同程度的退行性病变，进而导致黑色素细胞消失，细胞变性，皮肤褪色变白等种种临床症状[9]。NNED不仅给患者身心带来巨大负担，且研究表明，NNED是外阴癌出现的高危因素，因此，及时有效的治疗NNED十分必要。传统治疗NNED的方法包括药物、物理和手术治疗，但一直没有疗效稳定确切的标准治疗方式。多数NNED患者经过治疗依然出现病情反复或者疾病复发，导致患者病程长，增加患者心理和经济负担[10]。

超声波组织穿透能力强、携带能高、局部定位性强，是临床上用于治疗NNED的标准手段，因此，在本研究对照组患者接受常规聚焦超声治疗。竹红菌素可以在光照下被激活，具有抑菌可促循环作用，已有报道显示将两者合用可有效提高NNED的治疗效果，本研究结果显示，进行聚焦超声治疗的患者，1个疗程后病变处皮肤组织外观和瘙痒情况都得以极大的改善。这与HIFU的治疗机制有很大关系，HIFU有很强的组织穿透性，通过将声波能量聚集在较小的皮肤面积上形成高能量声波，通过超声波的热效应来破坏病变组织，从而发挥治疗作用[11]。HIFU可以通过破坏病变组织内部变性的毛细血管和神经末梢来促进正常组织细胞和毛细血管的生成，促进皮肤组织的修复和再生，从而改善皮肤瘙痒和色素改变的临床症状[12]。与单独接受HIFU的患者比较，接受联合治疗的患者1个疗程后临床症状改善更加明显，这是由于竹红菌素不仅具有较强的抑菌作用，还可以刺激局部皮肤的新陈代谢，增加微循环，从而有效加快皮肤再生和组织修复[13]。竹红菌素的光化学机制主要含有I、Ⅱ型光动力学过程，两种机制中光敏剂受光激发后产生活性氧（ROS），在有氧参与下，产生生物活性氧物质，如单重态氧、超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢等。活性氧能氧化细胞中的生物大分子，如蛋白、脂肪酸及蛋白间的桥连结构，破坏生物分子的结构和功能，改变生物膜渗透性和流动性，激活或抑制膜上的酶蛋白和受体，最终引起细胞的凋亡与坏死，从而起到杀菌抑菌的作用。

NNED虽然是一种发生在外阴的良性病变，但也有一定的恶变概率，目前认为，NNED与细胞周期失调和微循环障碍有关。因此，笔者还对P16和CD34蛋白进行研究。P16蛋白是调节细胞分裂周期的关键蛋白，在控制细胞增殖的过程中发挥十分重要的生理功能。研究认为[14]，P16对维持细胞中抑癌基因Rb的活性状态十分必要，通过与Cyclin依赖性激酶结合抑制原癌基因的活性，保证细胞增殖有序可控的进行。钟丽君等[15]的研究表明，在病变组织中P16蛋白的表达高于健康组织和病变旁组织，提示，P16蛋白在组织中的表达可能与NNED患者预后有关。在本研究中测量病变皮肤组织治疗前P16蛋白水平可以发现，两组患者经过治疗后P16蛋白水平均有所上升，提示再生的健康皮肤组织中P16蛋白含量也高于病变组织。CD34蛋白被认为是一种具有较高特异性的血管内皮细胞标志物，它在未成熟的血管内皮细胞中大量表达，通过对CD34蛋白的检测，可以反映组织内部新血管生成情况[16]。在病变的皮肤组织中，CD34蛋白表达增加，提示局部组织血管的过度增生可能与NNED发病相关。这也与之前的研究相符，杨静等[17]的研究认为在硬化性苔藓型病变的组织当中，CD34表达增加。经过治疗后的新生皮肤组织中，CD34蛋白表达趋于正常，也说明血管增生在NNED发病中可能起到关键作用。观察组患者治疗后P16蛋白水平更高而CD34蛋白水平更低可能与观察组患者病变出新生组织再生速度更快有关，竹红菌素对局部皮肤组织再生起到促进作用。

综上所述，聚焦超声联合竹红菌素软膏治疗NNED疗效显著，增加病变组织中P16蛋白含量，降低CD34蛋白含量，值得临床推广。