基于SPME技术的水产品风味化学研究进展

李博恩，仇玉洁，李晓月，贺 江，杨品红

（湖南文理学院生命与环境科学学院/环洞庭湖水产健康养殖与加工湖南省重点实验室/湖南省水产高效健康生产协同创新中心，湖南常德415000）

0 引言

中国水产资源丰富，水产品产量逐年增加。据全国渔业经济统计公报显示，2016年全国水产品总产量6901.25万t，比上年增长3.01%；全国水产品人均占有量49.91 kg，比上年增加1.17 kg，增长2.4%。这反映出近年来国民对于水产品的消费需求呈现出明显上升趋势。水产品中含有高质量的蛋白质，是人类满足蛋白质需求的良好资源。同时有关研究表明，鱼肉中还富含铁、锌、硒等微量元素以及牛磺酸、类胡萝卜素、甾醇等生物活性物质[1]，对于人体的生长发育具有积极作用。但是由于水产品或水产制品中存在独特的风味，包括令人愉快的和令人不愉快的，因此从食品感官角度看，会影响消费者的消费心理。为了降低对消费者的负面影响，同时更好地开发和利用水产品中的风味物质成分，指导水产制品生产，改进加工工艺[2]，近年来国内外学者对于水产品中风味的来源、组成成分进行了深入研究。

风味化学是研究食物风味的形成、风味物质的化学组成、风味物质的变化规律以及呈味物质的人工制造和风味食品的工业化生产等领域的一门学科。水产品的风味主要由挥发性风味物质和非挥发性滋味物质组成[3]，其中前者是决定水产品风味的重要因素，研究其组成成分和含量具有重要意义，可以提升水产品的质量评价[4]。水产品风味不是由单一物质作用产生，而是多种不同组分在数量上细微平衡的结果[3]，具有组分种类多、含量极微、稳定性差[5]等特点。因此，提取方法对于分析结果可靠性和准确性的影响较为明显，选择和使用合适的提取方法，对于其研究结果十分关键。SPME技术是一种新型的样品前处理技术，集采样、萃取、浓缩和进样于一体[6]。与其他常用的风味物质提取技术相比，该技术克服了传统样品前处理技术的缺陷，提取简便、快速，受到了研究学者的欢迎。笔者总结了近年来SPME技术在一些水产品风味物质提取上的应用，以期为有意深入了解此技术并应用于水产品风味物质研究的读者提供参考。

1 SPME技术的基本原理

固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)技术是Waterloo大学的Belardi等[7]开发出来的一种新型的样品前处理方法，是一种基于吸附剂萃取技术发展而来的，能在萃取的同时对分析物进行浓缩的操作技术，有直接、顶空和膜保护3种[9-10]萃取方式。该技术采用涂有固定相的熔融石英纤维来吸附、富集样品中的待测物质，具有操作简单、样品用量少、灵敏度高[8]等特点。随着科学技术的发展，SPME技术不断改进，经历了纤维针式固相微萃取(fibre SPME)、管内固相微萃取(in-tube SPME)[11]、搅拌棒式固相微萃取(stir bar sorption extraction，BSE)[12]几个阶段，富集倍数和萃取效率不断提高[13]。其操作流程分为萃取和分析2个部分（图1）：具有吸附涂层的萃取纤维暴露在样品中，在适当的外界条件下进行萃取，将挥发性风味物质成分富集在萃取头上；将已完成萃取过程的萃取针头插入精密分析仪器，如气相色谱进样装置的气化室内，使萃取纤维上的萃取物不断被载气吹过而解吸，进入后序的仪器进行分析。

图1 SPME方法的建立

SPME方法属于动态平衡萃取、非完全萃取，应用更加广泛。与一些传统的提取技术相比，SPME的优点较为显著。首先，SPME方法不需要溶剂，操作简单、高效、灵敏，成本低[13]。在过去一段时间里，固相萃取(Solid-Phase Extraction，SPE)也是一种常用的将待测物质与样品基质分离并进行净化和富集的样品前处理技术，但与SPME相比，SPE的缺点在于溶剂的选择较为麻烦，除了要将待测物全部萃取出来，还要考虑其与填料层和样品基质的匹配问题，因此溶剂的选择过程变得极为繁琐。况且风味化学的研究过程大多为探究成分未知的样品组分，这又给选择过程增加了难度，因此，SPME便成为了众多风味化学研究者的优先选择。其次，SPME可以与多种现代分析仪器联用[13]，如气相色谱、质谱仪和高压液相色谱等，实现自动化操作。前已述及，水产品风味的关键在于挥发性风味物质，因此挥发性是选择提取方式时要考虑的一个关键性质，所以自从20世纪60年代风味化学成为化学的一个新分支以来相当长的一段时间内，蒸馏法一直是研究者的一个倾向性选择。Likens和Nickerson于1964年首次设计发明的同时蒸馏萃取法[14]就是其中之一，此技术通过同时加热样品和有机溶剂的混合体系至沸腾，使风味物质溶入有机溶剂中，以达到提取和富集试样中挥发性、半挥发性成分的目的[2]。该方法使用萃取溶剂少，有良好的可重复性。但是该法过程耗时，可能会造成某些易挥发成分的损失，进而影响研究结果的全面性和准确性。除此之外，SPME方法萃取的量很小，不会对样品体系的原始平衡造成影响[13]，因此对基质的消耗可以忽略。

综上所述，鉴于其独特的优势，结合水产品中挥发性风味物质量小、成分复杂、需要用色谱、质谱等精密仪器综合分析的特点，SPME已被越来越多的研究者认可，被广泛应用于水产品风味化学的研究中。

2 SPME方法的建立

2.1 SPME萃取装置

SPME装置由萃取头和手柄构成，其中萃取头上的涂层是其核心[2]，萃取涂层的作用是实现对有机分子的萃取和富集，因此其性质要尽量与被提取物的性质匹配，从而使被提取物在涂层中有较快的扩散速度，进而能够在较短时间内达到分配平衡。其次，由于SPME装置可以与一些大型仪器联用实现自动化操作，所以萃取物一般都要在高温条件下解吸，这就要求涂层能够使萃取物在热解吸时迅速脱离，不会造成峰的扩宽[15]，正是这些技术要求的存在，促进了SPME萃取涂层的研发和改进。目前，涂层材料已经实现了商业化生产，不同种类的材料用于吸附不同性质的挥发性物质。与此同时，为了使SPME操作更加方便，以便助力此技术的推广，国内外许多学者对于SPME装置手柄部分也进行了大量的改进工作。

2.2 SPME的萃取条件

SPME的萃取过程是一个非常复杂的传质过程，除了萃取头的选择，实验条件也会影响萃取结果。如萃取温度对萃取的影响具有双重效应。在一定范围内升高温度，可以使提取物在基质中的扩散速度加快，达到平衡的时间缩短，可以减小潜在的损失以及富集物自身结构破坏的可能性；升高温度过多时会导致分析物在涂层中的分配系数降低，造成对分析物吸附量减小，从而影响SPME装置的灵敏度[16]。萃取时间也会受到待分析物的分配系数、物质的扩散速率等多因素影响[17]，影响富集物在涂层中的平衡，从而给分析结果增加了不确定性。除此之外，解吸时间、无机盐添加量等条件也会对萃取过程产生不同程度的影响。

胡静等[18]采用顶空固相微萃取法提取鳜鱼肌肉的挥发性风味物质，通过对比实验筛选了固相微萃取纤维头，优化了顶空固相微萃取的操作条件。结果表明用75 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷纤维头优于65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯萃取纤维头，在80℃下将鳜鱼肌肉样品顶空吸附40 min能达到最优的提取效果，然后在50℃条件下解吸5 min，而后用GC-MS对解吸物进行分离鉴定。结果共鉴别出37种挥发性成分，其中含量较高的是醛、醇、酮类化合物，据分析出的挥发性成分的风味特征可知对鳜鱼肌肉挥发性风味贡献较大的物质有己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、2,5-辛二酮等。翁丽萍等[19]以养殖大黄鱼为研究对象，对其主要挥发性风味物质的SPME-GC-MS分析条件进行优化，分组探究了不同的萃取头、萃取条件、分析条件等对SPME萃取结果的影响，而后将各组的实验结果整合。结果显示，采用DVB/CAR/PDMS涂层材料的SPME萃取头提取养殖大黄鱼的富集物，经分析后结果最为全面。此外，还探究了萃取的最适温度、合理的萃取时间等实验条件。

2.3 SPME的分析条件

SPME可以与多种现代分析仪器联用，实现自动化操作。从近些年从事风味化学研究的学者所报道的资料看，采用SPME技术与自动化分析仪器联用的实验方法占了很大比例。这些分析仪器主要有气-质联用仪、UPLC、电子鼻等。江健等[20]用65µm DVBPDMS的萃取头，采用顶空的方式萃取鲢、鳙、鲫、草鱼肉的样品，萃取温度50℃，萃取时间为30 min。然后将萃取样品加入到气相色谱仪中进行分析获得总离子峰图，结果非常清晰，将其与NIST质谱数据库检索和文献对照，分别检出4个样品中挥发性风味成分为40、42、42和31种，对其风味有较大贡献的主要是挥发性羰基化合物和醇类，同时含有少量的酯类和硫醚类化合物。陈俊卿等[21]以白鲢鱼为原料，采用涂有聚二甲基硅氧烷-二乙烯苯涂层的SPME萃取头，以鱼肉气味成分中含量比较多的己醛、己醇、庚醛、庚醇、辛醛、1-辛烯-3-醇、壬醛等为参照对象，比较了不同涂层的萃取头、萃取时间、萃取温度、解吸时间、程序升温速率等因素对固相微萃取的萃取效率的影响，建立了顶空固相微萃取技术与气-质联用仪联合分析鉴定鱼肉中风味物质的方法。结果表明，SPME装置有效地吸附了白鲢鱼中的挥发性成分，经NIST质谱数据库检索和文献对照，共确定27种物质。萃取过程简单、快速，不会对环境造成污染，为研究者带来了极大便利。施文正[22]用SPME结合电子鼻和气-质联用仪对养殖草鱼肉中的不同部位挥发性成分进行了对比研究，同时探究季节和鱼龄对养殖草鱼肉挥发性成分的影响，采用主成分分析对电子鼻数据进行分析，利用养殖草鱼不同部位对传感器响应值生成雷达和柱状图，用Xcalibur软件系统处理GC-MS数据生成总离子峰图，通过NIST和Wiley谱库确认定性，取得了非常好的成果。

3 SPME在水产品风味物质提取中的应用

3.1 水产品主要风味物质成分研究概述

风味物质影响着消费者对水产品的嗅觉感受，因此研究其组成成分及贮藏、运输过程中组成成分的变化对于水产品的销售具有重要意义。但天然混合体系中风味物质组分具有一定的复杂性和未知性，所以要实现尽可能完全的提取存在一定的难度，而SPME方法则可以在一定程度上减小由于这些困难对提取过程产生的影响。在SPME方法建立过程中，分析物在萃取涂层与样品基体中的分配系数较大，而样品本身体积很小，所以该分析物几乎可以代表样品中的各组分，这样的特点尤其适用于因样品量太小而不能直接进行分析的样品[23]，因此受到学者的广泛青睐。

中国的水产品市场庞大、种类丰富，有鱼、虾、蟹、贝4类，为消费者提供了多元化的选择，除鱼类外，研究和开发其他水产品的风味物质资源也具有十分重要的意义。解万翠等[24]采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱对虾头中的挥发性化合物进行分离与鉴定，选择C5～C20正构烷烃标准品，实现了对虾头中62种挥发性化合物的定性及半定量分析，取得了令人满意的成就。经RI值验证后得出结论，虾头风味物质中主要有烃类18种、酮类14种、醛类8种、醇类6种、脂类5种，还有一些杂环化合物及少量未知物。其中部分醇类和酮类化合物对虾头特征风味贡献较大。

20世纪90年代以来，外国学者对一些品种海水蟹的挥发性风味成分做了一定的研究报道[25-29]，鉴定其风味物质的组成成分。而他们研究时主要采取的提取方法是前已述及的同时蒸馏萃取法。但该法有提取温度较高、提取时间长的特点，因此提取过程极易造成某些易挥发性风味成分的流失甚至破坏，从而导致螃蟹整体风味发生变化[30]，影响实验结果的准确性。顾赛麟等[31]采用顶空的方式，用75 μm CAR/PDMS萃取头，在沸水浴下吸附50 min，然后用GC-MS方法共鉴定得到6大类77种化合物。对其中主要的挥发物含量、气味特征及其来源进行分析，根据所检出的物质种类推测出挥发性风味物质来源及其产生途径，如醇类可能是由于脂肪酸的二级氢过氧化物分解产生，结果较为合理。

贝类产品具有高蛋白、高微量元素和少脂肪等优点，其中素有“海底牛奶”美称的牡蛎肉更是以其味道鲜美、营养丰富、可提高机体免疫力而受到消费者的青睐。研究其体内挥发性风味物质对于进一步开发其加工制品、发挥其营养功能有重要意义。刘辉等[32]选取涂有聚二甲基硅氧烷-二乙烯苯涂层的SPME萃取头，萃取温度为60℃，萃取时间为30 min，采用直接萃取的方式提取牡蛎肌肉中的风味物质，而后通过气-质联用仪来分析鉴定牡蛎肌肉中的风味物质，经过NIST质谱数据库和文献对照，确定24种物质，其中叶绿醇、肉豆蔻酸、邻苯二甲酸二丁酯等化合物含量比较丰富，对于其独有的风味有较大贡献。实验提取效果较好，分析结果详细。郝帅[33]采取顶空的方式，将离心处理后的上清液置于顶空瓶中，在PAL自动进样器上以60℃预热20 min，而后采用二乙烯基苯/carboxen/聚二甲基硅氧烷固相微萃取纤维萃取，萃取后自动进样器将纤维转移至GC进样口进行分析，将结果绘制成以提取质量为横坐标，所检测到的峰面积与内标物的比值为纵坐标的各化合物的标准曲线，结果清晰明了。

3.2 水产品加工过程中风味物质的变化

中国从事水产捕捞历史悠久，捕捞经验丰富，但由于传统捕捞渔业已达到最大产量水平，发展水产养殖已成为填补水产品供应缺口的重要途径。改革开放以来，水产养殖业得到了快速发展。随着水产品养殖量的不断提高，人们的消费要求提高，除一部分就地鲜销外，很多水产加工业者都通过对水产品进行不同程度的加工来实现长期保藏或者制造成各类用途更广、价值更高的加工食品，以实现水产品营养价值利用的最大化。水产品加工方向有2种。一是以可食用部分制成腌熏制品、鱼糜制品等的食品加工业，二是以食用价值较低或不能食用的水产动物以及水产加工的废弃物等为原料，加工成鱼粉、鱼油等的非食品加工业[34]。但不论哪一种加工方式，都是以提高水产品的利用价值为目的，是延续渔业发展的重要方向。而研究加工过程中风味物质成分及其变化，可作为改进加工工艺时可利用的营养来源，也可以在某种程度上作为评价加工工艺合理性的参考指标。

杨立平等[35]利用顶空固相微萃取提取秘鲁鱿鱼丝加工过程中5个关键控制点的风味物质成分，通过分析其物质组分作为其品质变化指标。经过提取后以电子鼻和气-质联用仪分析共鉴定出119种挥发性物质，其中各关键控制点肉中分别是23、31、45、61、35 种，包括碳氢类、酯类、酮类、醛类、杂环类化合物等，结果表明，焙烤温度增加有利于形成更为丰富的风味[35]，通过SPME装置提取，他还探究了其他工艺条件对风味的影响，提取效果显著，检测结果较为全面，为改进秘鲁鱿鱼丝加工工艺和提高鱿鱼丝品质提供了理论依据。贡慧等[36]以秋刀鱼为研究对象，用固相微萃取-气质联用法分别提取和分析热加工前后秋刀鱼的挥发性物质，探究热加工对其风味物质成分的影响。结果在生鲜秋刀鱼中提取出27种挥发性风味物质，而115℃热加工后的秋刀鱼风味物质发生了明显改变。经分析，提取出的物质种类达到48种，主要包括醛类、醇类、酮类和杂环类化合物。而后结合电子鼻和感官评价的方法分析证实：酮类腥味物质种类和相对含量减少，油脂味、肉香味、烤肉香气等怡人风味物质含量增加；不同热加工温度对秋刀鱼风味物质构成产生不同影响，可参考性较高，为秋刀鱼产品热加工温度选择与优化提供参考。

腌干带鱼是中国传统的水产加工食品，主要是利用鱼肉自身携带的微生物在自然条件下进行发酵，而挥发风味是评价发酵制品品质优劣的重要指标之一[37]。吴燕燕等[37]采用顶空固相微萃取-气质联用技术对不同工艺腌制干带鱼的风味物质进行定性定量分析。在新鲜带鱼、传统腌干带鱼和发酵腌干带鱼中分别检测出27、45、56种挥发性物质，提取效果较好。分析证明醛类、醇类和酮类是构成腌干带鱼风味差异的主要化合物，其中鱼肉的特征风味物质包括己醛、苯甲醛、辛醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、1-辛烯-3-醇、己醇、3-甲基丁醇、3-羟基-2-丁酮和三甲胺等。吴燕燕等[38]为了研究不同腌制方法对鱼肉风味的影响，用固相微萃取-气质谱联用法分析测定比较了以鲜红牙䱛为原料，分别采用低盐乳酸菌法和传统法腌制的风味成分变化，结果显示醇、醛、酮类化合物是构成腌制干鱼肉独特风味的主要成分，经低盐乳酸菌法腌制的干鱼肉，对风味贡献较大的挥发性化合物总量达35种，而鲜鱼和传统法腌制干鱼肉中分别只有17和21种，为腌干鱼制品加工技术的选择和优化提供了理论依据。

迟明旭等[39]采用SPME方法提取用不同菌种发酵、传统发酵和原装市售鱼肉香肠中的挥发性风味成分，经NIST08.L质谱数据库检索对照，各检出26、22、17种影响风味的物质，检出影响鱼肉香肠风味的主要成分有醛酮类、醇类、酸类、酯类、烷烃类及其他化合物，并确定乙酸、己醛、1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯等是鱼肉香肠的特征香气成分。晁岱秀等[40]用感官分析和顶空固相微萃取-气质联用法对不同鱼样品经双酶处理制备的酶解鱼露风味进行了比较，结果表明，与鲜鱼酶解鱼露相比，盐渍鱼虽然降低了蛋白酶的酶解效果，但酶解鱼露风味较好，更接近传统鱼露的风味。盐渍鱼中没有检测出表现鱼露特征香味的挥发性风味物质，说明需要通过进一步发酵才能更接近传统成熟鱼露的风味。付娜[41]以草鱼鱼丸的制作过程为研究对象，选取新鲜草鱼鱼糜和熟制草鱼鱼糜作为样品探究漂洗次数、加热温度、食盐添加对鱼肉风味物质的影响，通过顶空固相微萃取方法提取后用气质联用仪分析，经NIST图库检测以及文献参考确认其风味物质组分的变化，明确了草鱼鱼糜在加工成鱼丸的过程中，重要工艺步骤对其挥发性风味物质的影响，揭示了草鱼鱼丸加工过程中挥发性风味物质的变化规律，为提高鱼糜制品品质提供了理论指导。

4 展望

随着SPME技术的优点被越来越多的研究学者接受，其应用领域也不断扩展，新的问题和要求也不断出现。纵观诸多学者的实验设计，鲜有探究不同搅拌速率对于萃取过程影响的讨论，而搅拌在萃取过程中对样品达到分配平衡很可能产生影响，因此笔者认为可加设此条件，对萃取条件再进行优化。而在设备方面，目前有国外的科技公司如美国康宁公司生产的SPME专用的磁力搅拌器，用以配合萃取过程，而国内的产品则不是很多。再有，从生物学角度来看，部分水产生物代谢途径已较为清楚，如有的学者就提到了一些水产生物产生风味物质的生理过程，那么可以考虑从这个角度，将萃取头的分类进一步细化，以某些化学性质如官能团作为吸附依据，研发更具有特异性的萃取头。分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，IPs)涂层具有机械强度较高、耐高温和耐溶剂性好等特点，尤其是具有高效选择特异性[42]，近年来受到研究学者的青睐，可作为今后的研究中新型涂层的开发和改进的方向。除此之外，未来可以将SPME与其他更多的分析技术结合，进一步提高分析的准确性，使水产加工企业更加详细地了解水产品中风味物质组成，从而能够充分利用水产资源，进行更加有利于人体健康的精深加工，这具有十分重要的现实意义。