转基因小鼠模型的制备与应用

范艳艳 钟磊发 肖义军

(福建师范大学生命科学学院 福州 350108)

1980年，Gordon等[1]首次利用原核显微注射法研究动物转基因技术，此后转基因动物研究得到了快速发展，其中利用转基因小鼠研究人类疾病的发病机制和治疗对策已经成为了研究热点。小鼠具有以下的生物学特性：发育与代谢过程与人类十分相似，其基因组与人的同源率高达95%；易于饲养、繁育，所需维护费用低。所以，相比于其他哺乳动物是较理想的实验材料。目前转基因小鼠模型在基因功能以及人类疾病机理与治疗研究领域得到了广泛应用[2]。所谓转基因小鼠模型是指能稳定表达外源基因、具有特定生物学特征的转基因小鼠。利用转基因小鼠模型，可进一步认识基因功能、构建特定的疾病模型、制备生物反应器等，对人类基因功能与疾病研究具有重要意义。

1 转基因小鼠模型的制备

转基因小鼠模型的开发与应用，克服了过去只能将外源基因导入单个细胞研究基因功能的弊端，可搭建特定基因与个体之间的桥梁，在活体动物中研究特定基因的生理功能。目前已有多种较成熟的转基因技术可用于制备转基因小鼠模型[3]。

原核显微注射法是目前最常用的转基因小鼠制备技术。它利用显微操作技术将外源基因导入小鼠受精卵的雄原核中，再将受精卵移植到假孕母鼠子宫内发育，生产转基因小鼠。在受精卵中，外源基因与受精卵的基因组发生随机整合，然后通过分子生物学方法筛选出整合了外源基因的新生小鼠。在此基础上，进一步筛选出能稳定表达外源基因、具有特定生物学特征的转基因小鼠。原核显微注射法具有转基因效率高、转入基因容量大(可达100kb)、实验周期短等优点，但也存在技术操作难度较大、基因表达精确度低等问题。此外，由于外源基因是随机整合于基因组中的，故整合的拷贝数无法人为控制，还可能因为引起原来基因表达水平的变化而导致小鼠死亡[4]。类似的转基因小鼠制备方法常见的还有精子载体法、脂质体介导法、体细胞核移植法等，其存在的问题与显微注射法类似。

近年来，基因组靶向编辑技术的发展有效解决了基因表达的精确度问题。最常用的基因组靶向编辑技术是来源于古细菌与细菌免疫系统的成簇规律间隔短回文重复序列核酸酶系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9， CRISPR/Cas9)，其核心部分为特异性核酸内切酶Cas9与向导RNA(single guide RNA， sgRNA)。人为设计的整合外源目的基因的特异性sgRNA可通过碱基互补配对原则识别基因组的靶序列，并引导核酸酶Cas9切割靶序列。目标DNA双链的断裂可激活真核细胞的DNA修复机制，通过非同源末端连接和同源重组，实现对基因组的靶向编辑。该技术基于RNA-DNA的相互作用，目的基因表达精确度高，但sgRNA的设计与构建难度较大，时间周期较长、成本较高[5]。常见的可实现基因组靶向编辑的方法还有锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)、基因打靶技术、RNA干扰技术等，在实现较高的基因表达精确度的同时，也存在技术难度大、科研成本高等问题。

2 转基因小鼠模型的应用

2.1 探索基因功能 生物学的发展逐渐阐明了器官、组织、细胞乃至基因的功能与作用机制。基因是人类生长发育的总指挥，关键基因的突变可导致疾病发生甚至个体死亡。因此，明确重要基因的功能对基因疾病的预防、早期诊断、治疗等至关重要。利用转基因技术可构建特定基因敲除或过表达的转基因小鼠模型，模拟人体的生理环境，在小鼠体内进行基因功能研究，探索基因功能。

2.2 构建转基因小鼠疾病模型 基因突变是引发疾病的重要因素，利用遗传学方法在短期内获得特定基因突变并患病的转基因小鼠模型，为疾病治疗与药物开发提供大量临床前试验材料。目前广泛应用的有肿瘤、阿兹海默病及糖尿病等转基因小鼠模型。

转基因小鼠在肿瘤治疗研究中扮演着重要角色，目前已建立多种肿瘤的转基因小鼠模型。例如，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)是肝癌的主要诱因之一，HBV长期感染宿主后，病毒基因可整合到宿主基因组中，引起基因突变、基因重组等，从而引发肝癌。研究发现，乙型肝炎病毒中由X基因编码的HBx蛋白为反式转录激活因子，可促进相关原癌基因表达，利用原核显微注射法将X基因及其启动子与增强子导入小鼠受精卵的雄原核中，经过培育、筛选后，获得HBx转基因肝癌小鼠模型，其成癌率为70%～85%，因此该模型在HBV诱发肝癌机制的研究中运用广泛。研究揭示了HBx促进肝癌发生的多种作用机制：如加速肝细胞凋亡、参与DNA修复与合成以及干扰细胞周期等，并进一步明确了药物的影响与功效[6]。类似的研究有利用小鼠乳腺癌病毒(MMTV)长端重复序列与ras基因和myc基因连接构建的乳腺癌小鼠模型，利用癌基因、细胞周期因子构建的TCL-1、TCL-1×P53-/-白血病小鼠模型以及利用抗原癌基因SV40T与胰岛素基因构建的胰岛癌小鼠模型等。癌症小鼠模型的应用可提供肿瘤早、中、晚期的临床前数据，并针对各时期的肿瘤特征采取治疗措施，为临床研究提供参考。

研究表明，10%的阿兹海默病(Alzheimer disease， AD)患者有明确的家族史，目前已确定与AD发病相关的基因有淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein， APP)基因突变、早老素Ⅰ(PS1)基因突变、早老素Ⅱ(PSII)基因突变和α巨球蛋白基因突变等，并构建了50多种AD转基因小鼠模型。以APP转基因小鼠模型为例，APP广泛分布于全身组织，经蛋白酶裂解后产生具有神经毒性的β淀粉样蛋白。为阐明AD的发病原因是否与APP基因突变相关，通过原核显微注射法将APP基因整合到小鼠基因组中，筛选获得稳定遗传APP基因过表达的转基因小鼠模型，或利用CRISPR/Cas9技术设计相应的sgRNA使APP基因片段被核酸酶Cas9切除，构建APP基因敲除的转基因小鼠模型。研究发现，APP基因过表达的转基因小鼠可在脑部过表达突变体人源APP基因，从而引发相关病变与认知损伤。重要的是，这些病变均与人类患者的临床特征相似。

因此，APP转基因小鼠模型可模拟人类患者的生理特性，通过研究患病小鼠本身的海马结构、线粒体自噬的变化、AD的发病机制、药物对AD治疗的作用机制等，可以探索人类AD患者的治疗措施[7]。此外，转基因小鼠模型也用于研究糖尿病等慢性代谢紊乱疾病，糖尿病分为胰岛素依赖型(即Ⅰ型糖尿病)和胰岛素非依赖型(即Ⅱ型糖尿病)，均存在家族遗传。利用原核显微注射法等转基因技术，可构建浆细胞抗原Ⅰ基因过表达或敲除的小鼠模型，研究浆细胞抗原Ⅰ与Ⅱ型糖尿病的相互关系。此外，还可以通过异常表达胰岛素受体、胰岛素下游信号元件等关键基因构建转基因小鼠模型，从基因的角度上更好地了解糖尿病的发病机制。

2.3 构建生物反应器 转基因小鼠除构建疾病模型外，还可作为生物反应器使用。利用转基因技术，将特定的人源基因转入小鼠体内，构建转基因小鼠生物反应器，使其生产特定蛋白质、激素、多肽等物质。常用的转基因小鼠生物反应器类型有：乳腺、血液、膀胱生物反应器，可通过小鼠的正常生命活动制备人类所需药物，既不威胁小鼠的生命安全，又可为生物医药提供巨大的便利，被广泛应用。相比传统的细菌、真菌生物反应器，转基因小鼠作为生物反应器，提取物的生物活性较高。目前，已经可以通过转基因小鼠生物反应器制备人类的胰岛素、抗体、干扰素和生长激素等重要药物[8]。

3 结论与展望

转基因小鼠模型的应用为基因功能和疾病发病机制的阐明及治疗药物的开发做出了巨大贡献。除癌症、糖尿病及AD外，多种自身免疫系统疾病、代谢疾病、遗传性疾病、心血管疾病均可构建转基因小鼠模型。此外转基因小鼠模型还可用于药物毒理实验、器官移植与再生等领域。

总之，转基因小鼠模型的应用必将逐步向着多元化、多领域、多分支的方向发展。