超声波萃取方法对螺旋藻叶绿素含量的影响

杨军 王艳菊 曹菊秀 白永文

摘 要：运用分光光度法对螺旋藻中叶绿素含量进行检测，运用超声波细胞破碎仪在不同萃取温度、萃取时间及萃取剂条件下对叶绿素进行样品前处理，再对含量进行测定。萃取温度对测定螺旋藻中叶绿素含量具有一定影响作用，测定其含量的适宜萃取温度为20～22℃；萃取时间对测定螺旋藻中叶绿素含量也具有影响，利用超声波细胞破碎仪的适宜萃取时间为1.5～2h，比原来的8h大幅减少；此外，萃取剂对螺旋藻叶绿素含量的影响最大。萃取剂不宜选择单一的有机溶剂，通过不同的体积比混合乙醇和丙酮后，能够促进叶绿素检测结果含量明显提高，通过实验发现，最适宜的萃取剂为1：1：1的乙醇（分析纯）、丙酮（分析纯）、乙醚（分析纯）混合剂。

关键词：超声波萃取；螺旋藻；叶绿素含量

中图分类号：S968 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20180833001

螺旋藻中含有丰富的叶绿素，而叶绿素对血红素水平具有有效的改善作用，可促进血液循环系统功能提高。螺旋藻叶绿素含量这一指标可用于估测藻类的生产力和生物量。叶绿素的可见光波段的吸收光谱，在蓝光和红光处各有一显著的吸收峰，吸收峰的位置和消光值的大小随叶绿素种类不同而有所不同，叶绿素a最大的吸收光波长在420～663nm，叶绿素b的最大吸收波长范围在460～645nm。目前使用的7种检测叶绿素试样的制备方法可总结为常温常压条件下的研磨法和浸提法。

研磨法，对试样进行研磨，以此来提取试样中的叶绿素含量，将研磨好的叶绿素提取液过滤洗涤，定容到容量瓶中，进行分光光度法分析。在该方法的测定过程中研磨方法可能对于叶绿素含量存在一定的影响。

浸提法，将试样制备均匀，将这些均匀的试样放入盛有提取液的容量瓶中封口，至于黑暗中直接浸提，用分光光度计测量。不过浸提法的测定用时较久，而且不同浸提液测定的值也可能存在比较大的差异性。

检测叶绿素的标准方法均为分光光度法，但采用的分光光度计的测定波长有所差异，波长范围为620～720nm。通过对目前所有检测方法比较分析，研磨法试样制备，耗时较长，对检验人员的研磨经验要求较高，复现性和稳定性不好；浸提法试样制备方法比较粗糙，达不到充分提取叶绿素的状态。超声波萃取法对的试样制备、萃取液选择、波长的确定等程序进行逐一优化、结合、改进，实现螺旋藻中叶绿素检测方法简化，效率得以较大提升，重复的稳定性更好。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

由云南省螺旋藻产品质量检验中心提供螺旋藻原料。主要试剂为乙醇（分析纯）、丙酮（分析纯）、乙醚（分析纯）。

1.2 设备和仪器

电子天平：型号BSA224S-CW；最大称量220g；精度0.1mg。

超声波细胞破碎仪：型号Scientz-650E；功率5～650W可调；脉冲0.1～99.9s可调；定时0～999min设置。

双束紫外可见分光光度计：设备型号TU1901；功率200W；等级Ⅱ级。

另外还有电热恒温鼓风干燥箱等辅助设备。

1.3 方法

准确称取螺旋藻粉样品0.2g（精确0.1mg）置入50mL比色管中，加入按照1：1：1比例配制好的乙醇（分析纯）、丙酮（分析纯）、乙醚（分析纯）混合溶剂25mL后，用超声波细胞破碎仪超声1h，倾出到250mL的分液漏斗中，加入50mL乙醚继续进行萃取，在萃取液中加入100mL超纯水，轻荡、静置，弃去下层溶液，萃取溶液经过10g无水硫酸钠收集于100mL容量瓶中，用乙醚定容。

1.3.1 萃取温度

对称取的0.2g（精確0.1mg）螺旋藻粉样品，置入50mL比色管后，加入25mL混合萃取剂，用超声波细胞破碎仪进行超声。温度当控制在正常室温，最佳温度为20～22℃，温度太低会导致有机溶剂结晶，温度偏高会导致有机溶剂快速挥发，均不利于样品前期处理的效果。

1.3.2 萃取时间

对称取的0.2g（精确0.1mg）螺旋藻粉样品，置入50mL比色管后，加入25mL混合萃取剂，用超声波细胞破碎仪进行超声。温度当控制在正常室温，最佳温度为20～22℃，萃取时间分为3个节点，分别为0.5h、1.0h、1.5h，每个进行3次重复处理，对最优萃取时间下萃取液的吸光度进行有效检测。

1.3.3 萃取剂

对称取的0.2g（精确0.1mg）螺旋藻粉样品，置入50mL比色管后，分别加入25mL的C1（分析纯的乙醇）、C2（分析纯的丙酮）、C3（分析纯的乙醚）、C4（按照1：1：1比例配制好的混合溶剂）共4种萃取剂，在20～22℃环境下进行萃取，用超声波细胞破碎仪超声1.0h，倾出到250mL的分液漏斗中，加入50mL乙醚继续进行萃取，在萃取液中加入100mL超纯水，轻荡、静置，弃去下层溶液，萃取溶液经过10g无水硫酸钠收集于100mL容量瓶总，用乙醚定容后，对不同萃取液进行检测，准确记录结果进行有效比对。

1.3.4 计算叶绿素含量

经萃取后的溶液，用乙醚定容至刻度后，立即用紫外可见分光光度计在642nm及660nm波长处进行吸光值测定，1cm比色皿，用乙醚作空白。按照叶绿素质量分数的相关公式对其质量分数进行准确计算，测定结果以平行试验的算术平均值计，保留到小数点后1位。

2 结果

2.1 螺旋藻中叶绿素含量受萃取温度的影响情况

见表1。

叶绿素含量受不同萃取温度的影响明显。在20～22℃萃取温度条件下，螺旋藻中叶绿素含量最高，在低于20℃条件下萃取，测得的含量偏低，在大于23℃条件下，也明显偏低。可见，萃取温度对测定螺旋藻叶绿素含量具有显著影响作用，通过分析，萃取温度的高低直接影响到有机溶剂对样品的萃取效果，故而影响最终叶绿素的检测结果。

2.2 螺旋藻中叶绿素含量受萃取时间的影响情况

见表2。

可见，萃取时间对叶绿素含量有一定的影响。在1.5h萃取时间下，叶绿素含量最高，在大于2h萃取时间时，对叶绿素含量已经没有多少变化，显得多余。在低于1h萃取时间下，相比于其他萃取时间，叶绿素含量与其之间的差异明显。可见，萃取温度对测定螺旋藻叶绿素含量具有一定的影响，测定其含量的最佳萃取时间为1.5h。

2.3 螺旋藻中叶绿素含量受萃取剂的影响情況

不同萃取剂对叶绿素含量的影响显著。常规方法使用的萃取剂为乙醚，通过试验，发现单一萃取剂对样品的萃取效果并不理想。本试验使用4种萃取剂，分别是C1（分析纯的乙醇）、C2（分析纯的丙酮）、C3（分析纯的乙醚）、C4（按照1：1：1比例配制好的混合溶剂）共4种萃取剂，叶绿素通过C4萃取剂萃取，其存在最高的含量，且与C1、C2、C3萃取剂之间的差异明显，可见，萃取剂不适宜选择单一的乙醇、丙酮或乙醚，通过相同的体积比按照1：1：1比例配制的乙醇（分析纯）、丙酮（分析纯）、乙醚（分析纯）混合溶剂，能够促进螺旋藻中叶绿素含量显著提高。

3 结论

螺旋藻是古老的微生物之一，分布在热带、亚热带地区。是一类低等生物，由单细胞或多细胞组成的丝状体，圆柱形，呈疏松或紧密的有规则的螺旋旋形弯曲，故而得名。作为地球上最古老的物种之一，因各种生物活性物质和营养物质存在于螺旋藻中，因此该物质属于优质菌体蛋白，且具有“食药同源”的作用，被人类食用已有100多年的历史。联合国粮农组织把螺旋藻认定为“2l世纪最理想的食品”。螺旋藻中的极大螺旋藻、钝顶螺旋藻两个品种允许作为保健食品的原料。螺旋藻中蛋白质含量比例较高，高达60%～70%，且消化吸收率高达95%以上，还含有丰富的类胡萝卜素和B族维生素，具有较高的营养价值。

本文在使用紫外可见分光光度法测定螺旋藻中叶绿素含量过程中，利用超声波细胞破碎仪进行样品处理，同时加入混合有机溶剂，探究出温度、时间、萃取剂等相关影响因素，旨在对叶绿素含量进行快速测定。通过实验发现，最佳萃取温度为20～22℃，利用超声波细胞破碎仪的适宜萃取时间为1.5～2h，萃取剂为乙醇（分析纯）、丙酮（分析纯）、乙醚（分析纯）按照1：1：1比例配置的混合溶剂。此方法与以往样品处理方法最不同地方是利用了超声波细胞破碎仪和使用了混合溶剂，极大的缩短了样品处置时间，从以前的8h，缩短到2h以内。上述方法操作简单易行，具有良好的萃取效果，确保能够有效运用紫外可见分光光度法对藻类叶绿素含量进行准确测定。

参考文献

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