氯霉素对大型溞的急性和慢性毒性效应研究

杨灿，沈根祥，胡双庆,*，朱英，张洪昌，曹国民,#

1. 华东理工大学，上海 200237 2. 上海市环境科学研究院，上海 200233

氯霉素(chloramphenicol, CHL)是首种被大规模生产的抗生素[1]，具有广谱杀菌效果，能有效抑制多种好氧和厌氧微生物，是一种非常有效的兽药。同时，氯霉素曾被推荐用于预防沙门氏菌感染，被广泛应用于水产养殖业[2]。但氯霉素有严重毒副作用，水中残留氯霉素会诱发致病菌的耐药性，易引起粒状白细胞缺乏症、再生障碍性贫血等症状，对人类健康构成巨大的威胁，表现出潜在的生态和健康风险[3]。食用水产品中氯霉素的残留是不可接受的，基于人类健康角度，氯霉素已被我国列入渔药禁用清单[4]，但目前仍然可以在水生生物体内和环境介质中检出[5-7]。

大型溞(Daphniamagna)是国际公认的标准试验生物，自1978年被美国环境保护局(EPA)确认作为毒理生物模型以来，以其对毒物敏感、取材容易、试验方法简便等多种优点，受到科学界的重视和关注[8-9]。大型溞生活于自然水域，属于浮游甲壳类动物，是水生浮游动物的代表，是连接水生食物链的重要中间体，与大部分环境介质都有相互作用，因此与其他水生生物相比，更容易受到摄入污染物颗粒的影响，且对净化水体有重要作用，是监测评价水环境质量的重要指标[10]。

目前，以大型溞为受试生物的毒性研究主要局限于农药(如三氯杀螨醇[11]、草甘膦[12])、阻燃剂(如四溴双酚A和三溴苯酚[13]、2,2’,4,4’-四溴二苯醚[14])等，关于抗生素对大型溞的毒性研究，主要集中在四环素类、磺胺类、氟喹诺酮类[15]，对于氯霉素的研究报道比较缺乏。因此，本研究以大型溞为受试生物，考察氯霉素对大型溞的48 h急性毒性和21 d慢性毒性效应，为水环境中氯霉素的毒性效应评估提供科学依据，并通过急性毒性和慢性毒性效应结果的比较，确定氯霉素的急慢性毒性比，为氯霉素的环境风险表征提供生态毒理数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料和仪器

受试生物大型溞溞种来自上海海洋大学，经本实验室室内保种培养，表观健康，喂食小球藻(Chlorellasp.)。急慢性实验受试大型溞为本实验室培养的同一健康亲溞孤雌生殖3代以上的幼溞，溞龄24 h以内，均为健康、活泼、体型均匀的个体。实验液均用Elendt M7培养基，实验之前，母溞在Elendt M7培养基中预培养7～10 d，培养条件为19～21C，光暗比为 8 h:16 h，光照强度为1 000～1 500 lux。急性实验期间不喂食，慢性毒性实验开始，用小球藻浓缩液定期投放，投饵量(以碳计)为0.1～0.2 mg·溞-1·d-1。

受试物氯霉素为HPLC级的标准品，购自中国国药集团化学试剂有限公司，氯霉素基本理化性质见表1。HPLC分析使用Milli-Q超纯水，使用甲醇为优级纯，购自TEDIA公司。Elendt M7培养基主要药剂成分包括H3BO3、MnCl2·4H2O、RbCl、Na2MoO4·2H2O、Na2SiO3·9H2O、维生素B1、维生素H、维生素B12等，其中H3BO3、MnCl2·4H2O、RbCl、维生素B1、维生素H均购自国药集团化学试剂有限公司，H3BO3、MnCl2·4H2O为分析纯，RbCl为光谱纯；Na2MoO4·2H2O、Na2SiO3·9H2O购自中国医药(集团)上海化学试剂公司，均为分析纯；维生素B12购自北京索莱宝科技有限公司。

主要仪器：高效液相色谱仪(Waters e2695，沃特世科技(上海)有限公司)，光照培养箱(MLR-352-PC, Panasonic)，pH计(S220，梅特勒-托利多)，溶解氧测定仪(SevenExcel lence, YSI Instruments)。

1.2 实验方法

1.2.1 氯霉素分析方法建立及方法学验证

为确认实验期间氯霉素的稳定性及换水频率，采用HPLC分析实验溶液中氯霉素的浓度。高效液相色谱检测器为紫外检测仪，参考文献[16]进行流动相优化，确定液相条件为：XBridgeTMC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为水-甲醇(V:V=30:70)，柱温25C，检测波长274 nm，流速1 mL·min-1，进样10 μL。

标准曲线及检出限：准确称取氯霉素标品，用甲醇溶解制成1 000 mg·L-1的溶液。逐步稀释后得到浓度组A：0.41、1.23、3.70、11.11、33.33 mg·L-1和浓度组B：11.11、33.33、100.00、300.00、600.00 mg·L-1，按上述液相条件进行测定。采用3倍信噪比(S/N)计算检出限(LOD)，采用10倍信噪比计算定量限(LOQ)。

精密度分析：准确称取氯霉素标品，配制浓度为1 000.00 mg·L-1的储备液，逐级稀释为0.625、20.00、100.00 mg·L-1的样品，各样品均连续进样7次。

回收率分析：准确称取氯霉素标品，配制浓度为1 000.00 mg·L-1的储备液，逐级稀释为0.625、20.00、125.00 mg·L-1的样品，各浓度均3份，通过HPLC测定浓度，以实测浓度与理论浓度比计算回收率。

稳定性分析：准确称取氯霉素标品，配制浓度为1 000.00 mg·L-1的储备液，逐级稀释为0.625、20.00、500.00 mg·L-1的样品，分别于0 h、24 h、48 h取样测定。

急性毒性实验在0 h、24 h、48 h取水样，慢性毒性实验在0 d、8 d、16 d、21 d换水前后取水样，通过HPLC测定溶液中氯霉素实际浓度。

1.2.2 急性毒性实验

实验方法参照OECD202[17]和GB/T 16125—2012[18]的方法。通过预实验，设置间隔较大的5个测试浓度，得出氯霉素对大型溞急性活动完全不抑制的最高浓度和100%活动抑制的最低浓度，从而确定正式实验的浓度范围。正式实验设置5个浓度组，分别为31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 mg·L-1，同时设空白对照组。实验用100 mL烧杯，内盛50 mL实验溶液，每个浓度设4个平行，每个烧杯中加入5只幼溞。放入培养箱中，温度控制在(20±1)C，光暗比8 h:16 h，暴露时间48 h，实验期间不喂食，不更换实验溶液。实验开始后，于24 h和48 h观察并记录大型溞活动抑制情况，并记录其他任何异常症状或表现。在0 h、24 h、48 h时测定并记录实验溶液温度、pH及溶解氧，同时取水样通过HPLC测定水样中氯霉素的实际浓度。

1.2.3 慢性毒性实验

实验方法参照OECD 211[19]和GB/T 21828—2008[20]的方法。根据氯霉素对大型溞急性毒性的实验结果，选择在20 mg·L-1内以2为等比设置6个浓度梯度，分别为0.625、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mg·L-1，同时设空白对照组。每个浓度设10个平行，每个烧杯中加入1只亲溞。实验持续21 d，实验温度(20±1)C，光暗比8 h:16 h，光照强度为1 000～1 500 lux，每48 h更换一次实验溶液。每天喂食小球藻浓缩液，喂食量(以碳计)为0.1～0.2 mg·溞-1·d-1。实验开始后，每天观察并记录大型溞存活和繁殖情况，从培养皿中移出幼溞并计数。在0 d、8 d、16 d、21 d更换实验溶液前后测定并记录实验溶液温度、pH、溶解氧，同时取水样通过HPLC测定水样中氯霉素的实际浓度。

1.3 数据统计与分析

采用概率单位法(Probit，SPSS 22.0)分析急性毒性和慢性毒性实验数据，得出EC50及95%置信限。急性毒性采用SPSS 22.0软件中单因素方差分析(One-way ANOVA)方法，确定不同浓度氯霉素是否对大型溞死亡产生影响，慢性毒性采用单因素方差分析中的邓肯检验(Duncan)进行分析，确定不同浓度氯霉素对大型溞繁殖的影响及差异性。

表1 氯霉素的基本理化性质Table 1 Physical and chemical properties of chloramphenicol (CHL)

注：pKa表示酸度系数；logP表示油水分配系数。

Note： pKa stands for acidity coefficient; logP stands for oil-water partition coefficient.

2 结果(Results)

2.1 实验溶液氯霉素浓度分析及稳定性

以氯霉素峰面积为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)，进行线性回归分析，浓度组A和B的结果见图1。由图可知，氯霉素检测浓度在0.41～600.00 mg·L-1范围内与峰面积积分值呈极好的线性关系(R2>0.999)，检出限为0.019 mg·L-1，定量限为0.064 mg·L-1。精密度实验结果显示，浓度为0.625、20.00、100.00 mg·L-1的氯霉素峰面积的RSD分别为0.38%、0.58%、2.28%(n=7)，说明仪器的精密度良好。回收率分析结果见表2，从低到高浓度分别为0.625、20.00、125.00 mg·L-1的氯霉素的平均回收率分别为100.59%、100.73%、99.29%，说明回收率良好。稳定性分析结果显示，浓度为0.625、20.00、500.00 mg·L-1的氯霉素在48 h后浓度实测为0.523、17.89、458.63 mg·L-1，表明48 h内实际浓度均在设定浓度的80%范围内，因而本实验以48 h作为换水频率。

慢性和急性毒性实验中氯霉素浓度分析结果见表3和表4。结果显示，氯霉素在整个实验期间，实测浓度都在设定浓度的80%～110%范围内。因此，可用实验设定浓度来代替实际浓度计算氯霉素对大型溞的急性和慢性毒性效应值。

图1 氯霉素浓度分析标准曲线Fig. 1 Standard curve for CHL concentration determination

加入量/(mg·L-1)Addition/(mg·L-1)测得量/(mg·L-1)Measured value/(mg·L-1)回收率/%Recovery rate/%0.6250.6320.6300.624100.59±0.6620.0020.1320.1020.21100.73±0.29125.00124.16123.10125.0699.29±0.78

表3 慢性毒性实验氯霉素浓度分析结果Table 3 Analysis results of CHL concentration in chronic toxicity test

2.2 大型溞的急性毒性效应

急性毒性实验过程中溶液pH在7.35～8.03范围内，温度控制在19.9～20.7 °C，溶解氧保持在9.00～9.38 mg·L-1之间。空白对照组的大型溞状况良好，无活动抑制发生。暴露24 h时，仅高浓度组出现活动抑制现象，抑制表现为体态发白并沉于溶液底部，250.00 mg·L-1浓度组抑制率为30%，500.00 mg·L-1浓度组抑制率为60%。随着暴露时间延长到48 h，250.00 mg·L-1和500.00 mg·L-1浓度组大型溞均已全部抑制，125.00 mg·L-1浓度组也出现活动抑制，抑制率为40%。可见，随着暴露时间的延长，大型溞的活动抑制率上升，呈明显的时间-效应关系，通过计算不同暴露时间大型溞急性毒性EC50值，可为后续慢性毒性实验的浓度设置提供参考。方差分析表明，氯霉素暴露对大型溞的活动产生显著抑制(F>>1)。

氯霉素对大型溞的急性活动抑制实验结果见表5。氯霉素对大型溞的48 h-EC50为129.47 mg·L-1，95%置信区间为124.36～150.89 mg·L-1。根据我国原国家环境保护局《化学农药环境安全评价试验准则》[21]中大型溞的毒性分级标准，氯霉素对溞类属于低毒物质。

2.3 大型溞的慢性毒性效应

慢性毒性实验过程中溶液pH在7.10～8.76范围内，温度控制在19.2～20.3 °C，溶解氧保持在8.04～9.50 mg·L-1之间。实验结束时，各组亲溞死亡率均未超过20%，平均每只存活亲溞所产成活幼溞数大于60只，证明了实验的有效性。14 d、21 d时氯霉素对大型溞的半数抑制浓度分别为15.91和15.59 mg·L-1(表6)。图2显示了各浓度组头胎溞的出生时间及总数，头胎溞总数为首次出现小溞当天10组平行产溞数总和。其中，空白组于实验第8天开始有部分亲溞产溞，总产溞数量为5只；0.625 mg·L-1浓度组第7天开始部分亲溞产溞，总产溞数4只；1.25 mg·L-1浓度组整体产溞时间推迟，但各亲溞均开始产溞，在实验第11天总产溞60只；2.50、5.00、10.00、20.00 mg·L-1浓度组头胎溞的出生时间在8～9 d之间，总数为2～9只。图3为不同暴露浓度氯霉素对亲溞产溞总数影响的统计分析结果，其总产溞数为21 d内平均单个亲溞产小溞总数。当暴露时间为14 d时，0.625、1.25 mg·L-1浓度组与空白组相比无显著性差异，当氯霉素浓度提高到2.50 mg·L-1时，开始对大型溞繁殖产生显著抑制作用。当暴露时间为21 d时，氯霉素5.00 mg·L-1以上浓度组，对大型溞的繁殖产生显著抑制，产溞数量由空白对照组的均值69只减少至均值57只以下。由此可见，氯霉素能抑制大型溞的繁殖，其对大型溞21 d繁殖实验的LOEC为2.50 mg·L-1，NOEC为1.25 mg·L-1。

2.4 急慢性毒性比

图2 氯霉素对亲溞首次产溞时间及产溞数量的影响注：柱外数据代表头胎溞出生时间。Fig. 2 Effects of CHL on the first brood time and size of Daphnia magnaNote: The number out of the column means the first brood time.

暴露时间TimeEC10/(mg·L-1)EC50/(mg·L-1)EC10 95%置信区间/(mg·L-1)EC10 95% confidential interval/(mg·L-1)EC50 95%置信区间/(mg·L-1)EC50 95% confidential interval/(mg·L-1)24 h209.97426.54NA324.29～649.9048 h102.94129.4725.13～113.10124.36～150.89

注：NA表示不适用。

Note： NA means not applicable.

在毒性实验中，由于慢性毒性实验花费时间较长，对实验条件要求高，人力物力消耗也较大，因此发展出利用固定因子来评估有害物质在环境中慢性影响的方法，即急慢性毒性比值(ACR)。根据国内外文献报道，Rodriguez等[22]通过急性毒性48 h-EC50除以慢性毒性数据计算ACR，袁慈君[23]以急性毒性的EC10取代慢性毒性数据计算ACR。本研究ACR1以48 h-EC50/chV(chronic value)计算，chV为NOEC与LOEC的几何平均值；同时与用急性毒性的EC10求出的ACR2(ACR2=48 h-EC50/48 h-EC10)进行比较，结果见表7。可见，ACR1是ACR2的58倍，水生生物毒性的ACR推荐值在100左右[24]，因而说明急慢性毒性比选用ACR1更加合理。

3 讨论(Discussion)

氯霉素对大型溞的急性毒性48 h-EC50为129.47 mg·L-1，其对溞类属于低毒物质。李霞[25]报道了氯霉素对隆线蚤(Daphniacarinata)的48 h-EC50为192.60 mg·L-1，与本研究结果比较发现，大型溞比隆线蚤对氯霉素更为敏感。另外，王慧珠等[26]等报道了四环素和金霉素对大型溞的48 h-EC50分别为617.2 mg·L-1和137.6 mg·L-1，Wollenberger等[27]报道了土霉素对大型溞的48 h-EC50为1 000 mg·L-1。与上述几种抗生素相比，氯霉素对大型溞的急性毒性最强。

氯霉素对大型溞的慢性毒性21 d-EC50为15.59 mg·L-1，其长期暴露能抑制大型溞的繁殖。Martins等[28]等报道了氟苯尼考对大型溞的21 d-EC50为7.6 mg·L-1。Wollenberger等[27]等报道了土霉素和四环素对大型溞的21 d-EC50分别为44.8 mg·L-1和46.2 mg·L-1，且长期暴露降低大型溞的产溞数量。相比于四环素类抗生素，氯霉素类抗生素对大型溞的慢性毒性相对较高。

人们希望能通过急性毒性实验结果推测长期暴露下的安全浓度。一般而言，当缺乏慢性毒性实验结果时，通过ACR值来推测慢性毒性的值。本研究利用慢性毒性数据得到的ACR1值为73.15，利用急性毒性数据EC10求出的ACR2值为1.26，显然ACR1值更接近推荐值100，这说明在环境风险评估中，若使用急性毒性数据EC10取代慢性毒性数据NOEC，很可能会对ACR取值造成较大影响。同时，刘少颖等[29]求得阿维菌素、联苯菊酯、氯菊酯和氟氯氰菊酯4种杀虫剂对大型溞的ACR介于6.17～134.4。Hickey[30]求得Cr6+、五氯苯酚、硼、氟化物及硫酸盐废水池出水5种有害物对大型溞的ACR介于1.3～13.5。可见，不同物质对大型溞的ACR值差异较大，在缺乏慢性毒性数据时，采用ACR值来预测安全浓度需谨慎。

图3 不同时间段氯霉素对亲溞产溞数量的影响Fig. 3 Effects of CHL on the number of total offspring per female of Daphnia magna during different periods

暴露时间TimeEC50/(mg·L-1)95%置信限/(mg·L-1)95% confidential interval/(mg·L-1)14 d15.91NA21 d15.5911.74～23.81

表7 氯霉素对大型溞的急慢性毒性比Table 7 Acute and chronic ratio of CHL to Daphnia magna

注：EC10表示10%抑制浓度，EC50表示半数抑制浓度，NOEC表示无可观察效应浓度，LOEC表示最低可观测效应浓度，ChV表示NOEC与LOEC的几何平均值，ACR1和ACR2为急慢性毒性比值。

Note： EC10stands for concentration for 10% of maximal effect; EC50stands for concentration for 50% of maximal effect; NOEC stands for no observed effect concentration; LOEC stands for the lowest observed effect concentration; ChV stands for the geometric mean of NOEC and LOEC; ACR1and ACR2stand for the acute and chronic ratio.

综上所述，氯霉素对大型溞属于急性毒性低毒物质，但长期暴露会抑制大型溞的繁殖，研究结果可为氯霉素的环境风险表征提供生态毒理数据。