加压毛细管电色谱法分离检测薯片中丙烯酰胺的含量

冯 军，肖晓茹，李利军2,,*，程 昊2,，黄文艺2,，李彦青2,，孔红星2,

（1.广西科技大学医学院，广西 柳州 545005；2.广西科技大学 广西糖资源绿色加工重点实验室，广西高校糖资源加工重点实验室，广西 柳州 545006；3.广西科技大学生物与化学工程学院，广西 柳州 545006）

2002年瑞典国家食品局报道了热加工食品中产生比饮用水中含量高500多倍的丙烯酰胺，随即引起了全球的广泛关注[1]。含淀粉类食品在高温加热过程中易产生高含量的丙烯酰胺[2-3]。研究发现，丙烯酰胺具有遗传毒性、神经毒性，可诱发动物机体癌变，是一种具有潜在致癌性的物质[4-5]。1994年国际癌症机构就将丙烯酰胺列为人类潜在致癌物[6]，因此对食品中丙烯酰胺的含量控制具有十分重要的意义。

目前用于食品中丙烯酰胺的检测方法主要有气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳技术等[7-13]。气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法灵敏度和准确度虽然较高，但一般需要衍生，操作繁琐，对设备要求很高。而高效液相色谱法虽最为常用，但由于食品基体复杂，样品预处理一般采用固相萃取法，以避免杂质干扰。这使得样品预处理步骤繁琐、复杂，成本较高、分析周期长。Zhou Xun等[13]采用胶束毛细管电泳对薯片中的丙烯酰胺进行了分离测定。该方法虽然避免了固相萃取的样品预处理，但由于在电泳缓冲溶液中加入了十二烷基硫酸钠作为准固定相以实现电泳分离，导致了其精密度不高、重现性略差。

与上述方法相比较，加压毛细管电色谱（pressurized capillary electrochromatography，pCEC）法具有高效液相色谱与毛细管电泳的双重分离机理，兼具两者的优势，根据待测物质分配系数不同以及电泳淌度的差异，对样品进行快速高效分离，具有选择性好、柱效高、分离快速等优点[14]。因此，pCEC尤其适于基体复杂、难于分离的多组分样品的分离测定。目前，pCEC已广泛应用于环境分析[15]、食品安全检测[16-20]、生物检测[21-22]、药物分析及中药分析[23-29]等研究领域。

本实验以薯片中微量丙烯酰胺为研究对象，将pCEC技术应用于油炸薯片中丙烯酰胺的含量测定，在流动相为乙腈-15 mmol/L NaH2PO4（pH 4.7）缓冲盐溶液（15∶85，V/V）、流速0.04 mL/min、分离电压-2 kV、紫外检测波长202 nm的条件下，薯片中的丙烯酰胺与干扰物质分离良好、结果准确，克服了常规检测方法存在的不足之处，同时拓展了pCEC法在食品安全检验中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丙烯酰胺对照品（纯度≥98%） 上海阿拉丁生化科技有限公司；4 种不同品牌的薯片样品 柳州市万达商业广场超市；磷酸二氢钠（分析纯） 广东光华科技有限公司；正己烷、乙醇（均为分析纯） 成都市科农化工试剂厂；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 德国Merck公司；实验用水为二次蒸馏水。所用的试剂和溶液在进入pCEC仪之前用0.22 μm微孔滤膜过滤，超声除气。

1.2 仪器与设备

TriSepTM-2100 pCEC 上海通微分析技术有限公司；HW-2000色谱工作站 上海千谱软件有限公司；SZ-93型自动双重水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂；UV-2102PC型紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；DL-60D型80 W超声波清洗器 上海之信仪器有限公司；Avanti J-HC型高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；PHS-25CW型实验室pH计 上海般特仪器有限公司；XW-80A型涡旋混合器 上海精科实业有限公司；0.22 μm尼龙66针式过滤器 天津市津腾实验设备有限公司；SHZ-D（III）循环水式真空泵 上海锦赋实验仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 对照溶液配制

称取0.008 0 g丙烯酰胺对照品于棕色容量瓶中，用二次蒸馏水溶解并稀释至100 mL，配制成80 μg/mL的对照品储备液，作为100%对照品工作液，用0.22 μm滤膜过滤，置于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3.2 薯片样品预处理

分别取市场上4 种不同品牌的薯片适量，研磨成粉。准确称取3.00 g（精确到0.01 g）已研磨的各种薯片样品分别置于50 mL的具塞离心管中，加入20 mL水和少量正己烷除酯，超声溶解30 min，置于高速冷冻离心机中，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，吸取下层水相5 mL，于离心机0 ℃、10 000 r/min离心10 min，收集上层清液3 mL，用0.22 μm滤膜过滤，放置冰箱中4 ℃避光保存。

1.3.3 pCEC条件的优化

色谱柱选用C18毛细管填充柱，柱子总长为45 cm，有效长度为20 cm，内径为100 μm，ODS填料3 μm；流动相：比较有机溶剂种类（甲醇、乙腈）、有机溶剂体积分数（10%、15%、20%）、NaH2PO4缓冲盐溶液浓度（10、15、20 mmol/L）及pH值（4.0、4.7、6.0、7.0）、分离电压（6、4、2、0、-2、-4 kV）各条件下对薯片样品中丙烯酰胺保留时间和分离度的影响；检测波长：对丙烯酰胺对照品溶液进行全波长扫描（190～400 nm），确定样品的检测波长；进样量40 μL，分流阀压力4.5 MPa；电压施加在毛细管的出口端，进口端接地。

1.3.4 pCEC分析方法学验证

1.3.4.1 线性关系与检出限

取不同体积（0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0 mL）的1.3.1节对照溶液配制的丙烯酰胺100%对照品工作液，用超纯水定容于10 mL容量瓶中，涡旋振荡摇匀，配制成体积分数分别为2.5%、5%、10%、20%、25%、40%系列对照品工作液，分别进行pCEC分析。计算丙烯酰胺的线性范围、回归方程及相关系数，并以3 倍信噪比对应的质量浓度确定丙烯酰胺的检出限。

1.3.4.2 精密度

同一天内连续6 次对同一丙烯酰胺标样进行pCEC分析，测定丙烯酰胺的保留时间和峰面积，计算精密度（以相对标准偏差表示）。

1.3.4.3 样品分析及含量测定

采用实验建立的分析方法，对已处理好的4 种不同品牌薯片样品溶液进行分析检测，每个样品平行测定3 次。

1.3.4.4 加标回收率

取上述等体积的薯片样品溶液3 份，分别添加体积分数5%、10%、20%低、中、高3 个水平的对照品溶液，进行pCEC分析，计算丙烯酰胺的加标回收率。

1.4 数据分析

数据采用OriginLab软件包中Originpro 8程序进行处理。

2 结果与分析

2.1 检测条件的确定结果

2.1.1 检测波长

用紫外分光光度计对丙烯酰胺在190～400 nm波长之间进行扫描，丙烯酰胺在202 nm波长处有最大吸收，因此选择202 nm作为检测波长。

2.1.2 流动相中有机溶剂的选择及优化结果

2.1.2.1 有机溶剂种类比较

图1 甲醇（a）和乙腈（b）对样品分离情况的影响Fig. 1 Effects of methanol (a) and acetonitrile (b) on separation of samples

由图1可知，甲醇作有机流动相时，待测物质峰存在杂质峰干扰，分析周期较长；而乙腈作有机流动相时，待测物质样品峰形尖锐，与相邻杂质峰之间能够得到完全分离，而且分析周期较短，因此选择乙腈作为流动相的有机相。

2.1.2.2 有机溶剂体积分数优化

由图2可知，随着乙腈体积分数的增大，样品中各组分保留时间缩短，这是因为乙腈比例增加，流动相黏度下降，电渗流增大，同时由于有机溶剂比例增加，洗脱能力增大，样品组分更容易被洗脱，因而保留时间缩短。当乙腈体积分数为10%时，样品中丙烯酰胺峰与杂质峰未完全分离；20%乙腈时，分析时间明显缩短，但丙烯酰胺峰与杂质峰基本重叠；15%乙腈时，杂质峰和丙烯酰胺峰分离良好，分析时间适中，所以选择15%乙腈作为最优体积分数。

图2 流动相中乙腈体积分数对分离效果的影响Fig. 2 Effect of mobile phases containing different percentages of acetonitrile on separation efficiency

2.1.3 缓冲盐

pCEC系统中，为了能够形成稳定的电场和电渗流，需要在流动相中加入可以电离的酸碱或者缓冲盐溶液[15]，缓冲盐溶液浓度决定了Zeta电位、双电层厚度和毛细管内壁表面电荷超量等。由图3可知，NaH2PO4缓冲盐溶液浓度为10 mmol/L时，丙烯酰胺峰柱效较低，杂质峰对丙烯酰胺峰存在一定的干扰，15 mmol/L时，丙烯酰胺峰与杂质峰之间的分离度良好，可达到基线分离。浓度为20 mmol/L时，由于电泳中高焦耳热的影响，待测丙烯酰胺峰增宽严重，柱效下降，以致于与相邻杂质峰重叠，无法得到很好地分离。实验选择15 mmol/L缓冲盐溶液为最优离子强度。

图3 缓冲盐浓度对分离效果的影响Fig. 3 Effect of buffer salt concentration on separation ef fi ciency

2.1.4 缓冲溶液pH值

从图4可以看出，随pH值升高，丙烯酰胺保留时间稍有缩短，但影响并不十分明显。而pH值对分离度的影响却非常关键，如图4所示，pH 4.0与pH 4.7时，样品电泳谱图未见明显变化，随着pH值升高，样品中丙烯酰胺与相邻杂质峰分离度逐步降低，当pH 7.0时，丙烯酰胺与杂质峰完全重叠，无法分离，所以选择不调节pH值（pH 4.7）为缓冲体系的最佳pH值。

图4 缓冲溶液pH值对分离效果的影响Fig. 4 Effect of buffer salt pH values on separation

2.1.5 分离电压

图5 分离电压对样品中丙烯酰胺分离效果的影响Fig. 5 Effect of separation voltage on separation efficiency

在实验中，毛细管入口是接地极的，正负极都施加在毛细管出口端。由图5a～c可知，正电压（6、4、2 kV）时，随着电压增大，丙烯酰胺出峰时间稍有延后，但未见明显变化，这是因为当在毛细管出口端施加正电压时，电渗流方向则朝着毛细管入口端，电渗流方向与压力流方向相反，随着分离电压的增大，电渗流也随之变大，丙烯酰胺受到的电场力也增大，电渗流作用力与压力流和电场力相互作用，使得丙烯酰胺的电泳表观淌度减小，出峰时间稍有延长。0 kV情况下，丙烯酰胺与杂质峰重叠（图5d）。

由图5e～f可知，负电压（-2、-4 kV）时，随着电压绝对值增大，丙烯酰胺出峰时间明显缩短，灵敏度提高，分离度有所降低，-2 kV时，丙烯酰胺与相邻杂质峰之间可得到基线分离。这是因为当在毛细管出口端施加负电压，电渗流方向朝向毛细管出口端，随着分离电压的不断增大，电渗流方向与压力流方向一致且逐步增大，丙烯酰胺在泵压力、电渗流和方向相反电场力的相互作用下，整体分析速度提高。综合考虑出峰时间，分离度和灵敏度，选择-2 kV作为样品的最优分离电压。

2.2 线性关系与检出限结果

将不同质量浓度的丙烯酰胺对照品溶液分别进样，采用pCEC进行分析，同一质量浓度重复进样3 次。取3 次平均峰面积（Y），对标准品质量浓度（X，μg/mL）进行线性回归。丙烯酰胺在2～32 μg/mL范围内线性关系良好，线性方程为Y=758.44X-130.84（r=0.999 4）。以3 倍信噪比为标准计算丙烯酰胺的检出限为0.30 μg/mL。

2.3 精密度实验结果

取上述配制好的体积分数为40%丙烯酰胺对照品溶液，在最优色谱条件下进样，重复进样6 次。丙烯酰胺峰面积的相对标准偏差为2.84%，表明该方法具有良好的精密度。

2.4 样品分析及含量的测定结果

经过条件优化后获得了最优pCEC分析条件：以C18色谱柱（柱长为45 cm，有效长度为20 cm，内径为100 μm）进行分离，流动相：乙腈-15 mmol/L NaH2PO4缓冲盐溶液（pH 4.7）（15∶85，V/V）；流动相流速为0.04 mL/min；分离电压为-2 kV；检测波长为202 nm。

采用优化后的分析方法获得的市场上4 种不同品牌的薯片样品以及丙烯酰胺标样的分析结果见图6和表1。薯片中丙烯酰胺的平均含量范围为1.867～4.232 μg/g。不同品牌薯片中丙烯酰胺含量略有差异，结果与文献[30]报道一致。

图6 丙烯酰胺样品的pCEC谱图Fig. 6 pCEC chromatograms of acrylamide standard, spiked potato chips, and commercial potato chips samples

表1 薯片中丙烯酰胺的含量（n=3）Table 1 Content of acrylamide in potato chips (n= 3)

2.5 加标回收率结果

按1.3.4.4节进行加标回收实验。丙烯酰胺在低、中、高的回收率分别为104.0%、95.3%、108.1%，相对标准偏差分别为0.93%、1.48%、1.36%，说明该方法准确度较高。

3 结 论

本实验建立了pCEC法检测食品中丙烯酰胺含量的新方法，通过对薯片样品中丙烯酰胺含量的检测，验证了该方法的可行性，为丙烯酰胺的分离测定提供了新的方法。丙烯酰胺实现了快速高效地分离，样品加标回收率为95.3%～108.1%，相对标准偏差均低于1.48%，检测限达到0.30 μg/mL。与高效液相色谱法相比，该方法简便易行，省略了固相萃取，简化样品预处理操作步骤；与胶束毛细管电泳方法[13]相比，低于胶束毛细管电泳相对标准偏差为2.61%～9.65%，精密度较好；这说明方法操作简单、快速高效、精密度高、检测限低，能够很好地对薯片中的微量丙烯酰胺进行分离测定，可对食品薯片的安全检测具有一定的借鉴和启发作用。