短梗五加果多酚提取工艺优化及抗疲劳作用

肖凤艳，高 磊，赵子健，栾 畅，段翠翠，赵玉娟，李盛钰,*

（1.吉林农业科技学院中药学院，吉林 吉林 132109；2.吉林省农业科学院农产品加工研究所，吉林 长春 130033）

短梗五加（Acanthopanax sessilif l orus (Rupr. et Maxim.)Seem）又名无梗五加，是五加科五加属（Acanthopanax Miq.）植物。2008年短梗五加茎、叶、果被国家卫计委公告批准为新食品原料。短梗五加果中含有多糖、花色苷、金丝桃苷、槲皮素、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸等成分[1]。近年来研究表明短梗五加果具有抗氧化、抗炎、镇痛、抗肿瘤、保肝等多种生理功能[2-3]。研究发现短梗五加果中提取的黄酮类化合物具有抗油脂氧化和清除羟自由基及超氧自由基的能力，并具有一定的抑菌活性[4]；短梗五加果中酚酸类成分具有抗炎、镇痛、抗焦虑、镇静、安眠等药理活性[5]；短梗五加果实的正丁醇萃取部分对自由基的清除率可达到80%[6]。

研究发现多酚具有抗氧化、抗菌、抗血栓、抗肿瘤和抗病毒等活性[7-11]，在抗褐变、降血糖、降血压、预防心血管疾病等方面发挥重要作用[12-16]。短梗五加果是一种富含黄酮、多酚的植物，目前国内外对短梗五加果的研究主要集中在短梗五加果黄酮类成分鉴定以及抗氧化功能等方面，对短梗五加果多酚的提取及抗疲劳作用研究鲜见报道。因此，本实验优化短梗五加果多酚的提取工艺并考察其对小鼠抗疲劳能力的影响，评价短梗五加果多酚在提高机体抗疲劳能力方面的作用，为短梗五加果多酚在功能食品中的应用及产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

短梗五加果干品购于辽宁丹东五加高新农业科技开发有限公司，鉴定为五加科五加属植物短梗五加果实，挑选饱满、干净、干燥短梗五加果实备用。SPF级雄性ICR小鼠（6～8 周龄）80 只（SCXK（吉）-2011-0004）长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

绿原酸标准品 上海源叶生物有限公司；D101大孔吸附树脂 天津南大树脂科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

小鼠血清肝糖原酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒、肌糖原ELISA检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶ELISA检测试剂盒、肌酸激酶ELISA检测试剂盒、乳酸ELISA检测试剂盒上海朗顿生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

BSZ-100型全自动收集器 上海沪西分析仪器厂有限公司；Sorvall Evolotion RC型高速冷冻离心机 美国Thermo公司；Cary 300紫外-可见分光光度计 美国Varian公司；ELx800型全自动酶标仪 美国BioTek公司；HZQ-Q型电热恒温培养箱 上海一恒实验设备有限公司；FSH-II型高速电动匀浆器 上海精密仪器有限公司；XW-80A涡旋混合器 上海精科实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 短梗五加果多酚提取物的制备

取3 kg短梗五加果干品，浸泡在45 L 50%乙醇溶液中，80 ℃回流提取2 次，所得提取液经300 目滤布过滤后，减压回收乙醇进行冻干，得短梗五加果多酚提取物。

1.3.2 短梗五加果多酚得率的计算

1.3.2.1 标准曲线的绘制[17]

精确称取绿原酸标准物4.50 mg置于小烧杯内加适量甲醇超声溶解后，定容25 mL制成标准品储备液（0.18 mg/mL）。精密吸取8、6、4、2、1 mL标准品储备液分别加入25 mL容量瓶内，加入质量分数5% NaNO2溶液1.0 mL，静置6 min；再加入质量分数10% Al(NO3)3溶液1.0 mL，充分混匀，静置6 min；再加入质量分数4% NaOH溶液8.0 mL，静置15 min；最后加入蒸馏水定容至25 mL，充分混匀，即为质量浓度分别为0.057 6、0.043 2、0.028 8、0.014 4、0.007 2 mg/mL的绿原酸标准溶液。于520 nm波长处测定各质量浓度标准品吸光度，绘制标准曲线。线性回归方程为Y＝17.995X+0.004 1（R2＝0.999 6）。

1.3.2.2 短梗五加果多酚得率的测定

精确称取短梗五加果多酚提取物12.50 mg，用甲醇定容至25 mL，得短梗五加果多酚提取液。再准确量取短梗五加果多酚提取液12.5 mL，加入质量分数5% NaNO2溶液1.0 mL，静置6 min；再加入质量分数10% Al(NO3)3溶液1.0 mL，充分混匀，静置6 min；再加入4% NaOH溶液8.0 mL，静置15 min，最后加入蒸馏水定容至25 mL，充分混匀，配制成待测样品液。于520 nm波长处测定吸光度，根据回归方程计算短梗五加果多酚提取物中多酚的含量，并以多酚得率表示。短梗五加果多酚得率计算见式（1）：

式中：C为短梗五加果提取液中多酚质量浓度/（mg/mL）；V为提取液总体积/mL；F为稀释倍数；m1为实验所取短梗五加果多酚提取物质量/mg；m2为短梗五加果多酚提取物总质量/mg；M为短梗五加果干品总质量/mg。

1.3.3 单因素试验[18]

采用体积分数50%乙醇溶液、提取温度80 ℃，提取次数分别为1、2、3、4，研究提取次数对短梗五加果多酚提取率的影响；提取时间分别为20、40、60、80 min，研究提取时间对短梗五加果多酚提取率的影响；液料比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g），研究液料比对短梗五加果多酚得率的影响。

1.3.4 正交试验[19]

在单因素试验基础上，选取液料比、提取次数、提取时间，分别设计3 个水平，以短梗五加果为原料进行正交试验，每个试验重复3 次，确定短梗五加果多酚提取的最佳工艺条件。因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and their levels used in orthogonal array design

1.3.5 短梗五加果多酚体内抗疲劳作用

1.3.5.1 实验动物分组及处理

实验室温度（2 3±2）℃，1 2 h光照/黑暗循环，自由饮食摄水，适应性喂养1 周。将80 只实验小鼠随机分成4 组，每组20 只：空白对照组（灌胃生理盐水1 2 m L/（k g·d））；模型组（灌胃生理盐水1 2 m L/（k g·d））；低剂量组（灌胃短梗五加果多酚100 mg/（kg·d））；高剂量组（灌胃短梗五加果多酚200 mg/（kg·d）），连续灌胃15 d。

1.3.5.2 负重游泳力竭时间的测定[20-22]

实验第15天给药30 min后，每组随机选取10 只小鼠（空白对照组不参与游泳实验），每只小鼠尾部负重5%体质量的铅块，单独放入装有（25±2）℃水的透明塑料水桶中游泳，观察小鼠游泳状况并记录小鼠游泳力竭时间，即小鼠自入水开始至完全沉入水底超过10 s的时间。

1.3.5.3 肝糖原、肌糖原、乳酸、肌酸激酶、谷胱甘肽过氧化物酶含量的测定[23-24]

实验第15天给药30 min后，每组随机选取10 只小鼠（空白对照组不参与游泳实验），每只小鼠尾部负重2%体质量的铅块，负重游泳60 min，建立小鼠疲劳模型。游泳结束15 min后摘取小鼠眼球取血，脱颈处死，迅速解剖分离脾脏、肝脏、肾脏并称取质量[25]，按式（2）计算脏器指数：

血液样品离心后收集血清，取肝组织、肌肉组织分装，均置于-80 ℃保存备用。参照试剂盒说明书测定小鼠肝脏中肝糖原含量、肌肉中肌糖原含量和小鼠血清中乳酸、肌酸激酶、谷胱甘肽过氧化物酶含量。

1.4 数据统计分析

正交试验所得结果由SPSS 19.0软件分析，确定因素水平的优劣，选择出最佳提取工艺。其余实验数据采用SPSS 19.0统计软件进行处理，均以表示，采用单因素方差分析，不同组间的比较采用方差分析比较，以P小于0.05判断为差异显著，P小于0.01判断为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 短梗五加果多酚提取单因素试验结果

由图1可知，随着提取次数的增加，短梗五加果多酚得率逐渐提高，但综合考虑提取时间和提取效率，提取次数选择2 次；随着提取时间的延长短梗五加果多酚得率逐渐提高，提取60 min多酚得率最高，提取时间过短多酚提取不完全，提取时间过长会增加能耗，同时多酚类物质的稳定性将变差，从而降低多酚得率，因此提取时间选择60 min；随着提取溶剂用量的增加，溶剂能够溶解的物质质量在不断增大，短梗五加果多酚得率逐渐提高，液料比为15∶1（mL/g），多酚得率为1.03%，液料比为20∶1（mL/g）多酚得率提高到1.34%，再增大提取溶剂用量，多酚得率提高并不显著，反而会增加后续浓缩的难度和成本，综合考虑选择液料比20∶1（mL/g）。

图1 单因素试验结果Fig. 1 Effect of various factors on extraction efficiency

2.2 短梗五加果多酚提取正交试验结果

表2 正交试验设计与结果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

由表2可知，3 个因素对短梗五加果多酚得率的影响顺序为C＞A＞B，即提取时间＞液料比＞提取次数。由表3可知，液料比和提取时间对短梗五加果多酚得率有显著影响（P＜0.05）；提取次数对短梗五加果多酚得率无显著影响（P＞0.05）。最后确定的最佳提取工艺条件为A3B2C2，即液料比20∶1（mL/g）、提取2 次、提取时间60 min。通过此最佳提取工艺条件进行3 次重复实验，短梗五加果多酚得率为1.426%。

表3 正交试验主体间效应检验Table 3 Analysis of variance for effect of various factors on extraction efficiency

2.3 短梗五加果多酚对小鼠体质量和脏器指数的影响

表4 短梗五加果多酚对实验小鼠体质量及脏器指数的影响Table 4 Effects of polyphenols from A. sessilif l orus fruits on body mass and organ indices in mice

从表4可知，实验前各组小鼠体质量均在27.64～28.27 g之间，低剂量组、高剂量组小鼠与模型组相比无显著差异（P＞0.05）。实验结束时各组小鼠体质量均正常增长，低剂量组、高剂量组小鼠体质量及各脏器指数与模型组相比均无显著差异（P＞0.05），灌胃短梗五加果多酚后小鼠肝脏指数、肾脏指数与模型组相比均无显著性差异（P＞0.05）。短梗五加果多酚对小鼠脾脏指数有增加的趋势但并无显著性差异（P＞0.05）。结果表明：短梗五加果多酚对小鼠体质量及脏器指数均无显著性影响。

2.4 短梗五加果多酚对小鼠游泳力竭时间的影响

由图2可知，模型组小鼠平均力竭游泳时间为83.72 min，短梗五加果多酚对小鼠负重游泳力竭时间有不同程度的延长，低剂量组时间为98.07 min，延长时间14.35 min，高剂量组时间为101.10 min，延长时间17.38 min，高剂量组和低剂量组与模型组比较均具有显著性差异（P＜0.05）。结果表明短梗五加果多酚能显著延长小鼠负重游泳力竭时间，提高小鼠的运动耐力水平。

图2 短梗五加果多酚对小鼠负重游泳力竭时间的影响Fig. 2 Effect of polyphenols from A. sessilif l orus fruits on exhausting swimming time in mice

2.5 短梗五加果多酚对小鼠肝糖原、肌糖原含量的影响

表5 短梗五加果多酚对小鼠肝糖原、肌糖原含量的影响Table 5 Effects of polyphenols from A. sessilif l orus fruits on liver glycogen and muscle glycogen levels in mice

如表5所示，疲劳模型组小鼠肝糖原平均质量浓度降低到2.53 mg/mL，与空白对照组相比降低18.39%。短梗五加果多酚抑制小鼠肝糖原消耗，造模后短梗五加果多酚低剂量和高剂量组质量浓度分别为2.92 mg/mL和3.03 mg/mL，与模型组相比消耗量被显著抑制（P＜0.05）。短梗五加果多酚能有效减少疲劳小鼠肌肉中肌糖原的消耗，与模型组相比短梗五加果多酚低剂量能提高肌糖原含量28.82%（P＜0.01），高剂量能提高肌糖原含量35.08%（P＜0.01）。结果表明短梗五加果多酚能有效促进肝脏和肌肉中糖原合成，特别是提高了肌糖原的储存能力，同时减少运动引起的肝糖原和肌糖原消耗，提高机体抗疲劳能力。

2.6 短梗五加果多酚对小鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶、肌酸激酶和乳酸的影响

表6 短梗五加果多酚对小鼠谷胱甘肽过氧化物酶、肌酸激酶和乳酸的影响Table 6 Effects of polyphenols from A. sessilif l orus fruits on glutahione peroxidase creatine kinase activity and lactic acid content in mice

由表6可知，灌胃短梗五加果多酚15 d后，高剂量组和低剂量组的小鼠运动后谷胱甘肽过氧化物酶活力均增加，其中低剂量组平均水平提高到114.67 U/mL，与模型组相比具有极显著差异（P＜0.01）；高剂量组谷胱甘肽过氧化物酶活力水平量提高到109.62 U/mL，与模型组相比差异显著（P＜0.05）。短梗五加果多酚能明显降低小鼠血清中乳酸含量，其中短梗五加果酚低剂量组和高剂量组乳酸水平分别降低10.96%和17.44%，与模型组相比具有显著性差异和极显著性差异（P＜0.05和P＜0.01）。游泳运动促进机体能源物质的代谢，导致小鼠血清中肌酸激酶与空白对照组相比含量明显升高，短梗五加果多酚低剂量组和高剂量组小鼠血清中肌酸激酶水平分别降低到26.43 ng/mL和26.57 ng/mL，与模型组相比差异显著（P＜0.05）。结果表明，短梗五加果多酚能提高小鼠体内谷胱甘肽过氧化物酶活力，有效降低小鼠血清中肌酸激酶活性，并能够不同程度的抑制运动后乳酸的含量升高，减轻机体代谢产物的堆积。

3 结 论

本研究采用正交试验考察液料比、提取时间、提取次数对短梗五加果多酚提取率的影响，确定最佳提取工艺参数为液料比20∶1（mL/g）、提取时间60 min、提取2 次，3 次重复实验，短梗五加果多酚得率为1.426%。本研究通过负重游泳实验建立小鼠运动疲劳模型，检测小鼠负重游泳力竭时间评价短梗五加果多酚的抗疲劳作用。机体运动时，肌肉收缩会消耗体内的糖原维持血糖水平，并为肌肉活动提供能量，延缓疲劳的产生[26]。实验结果表明，短梗五加果多酚能有效减少运动引起的肝糖原和肌糖原消耗，增加体内能源物质肝糖原和肌糖原的含量，增强小鼠游泳耐力，延长小鼠负重游泳力竭时间，延缓疲劳的产生。短时间高强度运动时，由于氧供应相对不足，糖原代谢增加，血清中乳酸、肌酸激酶等代谢产物增多，从而引起肌肉收缩效率下降导致体力衰竭[27-30]。测定结果表明短梗五加果多酚均能不同程度的减少运动后血清中乳酸、肌酸激酶水平，减轻机体代谢产物的堆积，改善机体能量代谢，有利于机体对抗运动性疲劳。目前，不少研究也证实了多酚类成分能延长疲劳小鼠的负重游泳时间，增加肝糖原、肌糖原的储备，表现出一定的抗疲劳作用[31-32]。

综上所述，本研究通过正交试验优化了短梗五加果多酚的提取工艺，并发现其具有显著的抗疲劳作用，其作用机制可能与糖原的储备及能量物质的有氧代谢有关，为其在抗疲劳保健食品的开发利用提供了理论依据。