鹿茸多肽联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对Aβ25-35诱导脊髓神经元凋亡的保护作用

张鹏程，冷向阳，路博丞，张远超，王 英，王旭凯

(1.长春中医药大学临床医学院骨伤科，吉林 长春 130021；2.长春中医药大学附属医院骨伤科，吉林 长春 130021)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)属于中枢神经损伤的一种，伴有极严重的致残致死率，常见于交通和活动等意外，对个人及社会造成极其重大的影响[1]。SCI分为原发性损伤和继发性损伤两类。原发性损伤是直接暴力作用于脊髓所造成的，多属于高能量伤所致[2]，可直接造成神经元、胶原及血管的即刻性细胞死亡。细胞凋亡是一种常见的生命现象，是某种或几种基因调控下的细胞主动死亡过程。SCI后，有许多因素可诱导脊髓神经元凋亡[3]。研究[4]显示在机体神经损伤的急性期细胞凋亡的作用尤为主要。近年来SCI后神经的修复问题一直是医学界研究的热点和难点，而其细胞凋亡机制研究受到高度重视[5]。鹿茸多肽(velvet antler polypeptides，VAP)是从鹿科雄性梅花鹿幼角中提取的一种蛋白多肽类活性因子，具有促进神经再生的功效[6]。研究[7]证实：VAP可使β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)诱导大鼠腹部脊髓神经元凋亡，细胞中caspase-3表达下降，VAP对Aβ25-35诱导产生的大鼠腹部脊髓神经元凋亡具有一定抑制作用。体外实验[8]表明：胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)基因修饰的雪旺细胞(Schwann cells，SCs)可抑制脊髓神经元凋亡，并且对脊髓神经功能的修复具有一定的促进作用。本研究探讨VAP联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对脊髓神经元凋亡的保护作用，旨在为临床上治疗SCI提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞、主要试剂和仪器 选用清洁级8～16周性成熟Wistar大鼠160只，雌雄各半，雌性大鼠体质量200～ 220 g，雄性大鼠体质量220～250 g，动物合格证编号：SCXK-(吉)2011-2014，购自吉林省长春市亿斯实验动物技术有限公司。实验大鼠饲养温度保持为18℃～ 25℃，自然采光，通风良好，湿度保持在60%～ 70%，普通饲料喂养，食水正常。每日定期维护鼠笼的清洁，确保饲养环境的洁净无外界打扰。实验前饲养大鼠适应实验室5 d后开始实验。SCs和GDNF由吉林大学基础医学院医学生物学实验中心提供；VAP由长春中医药大学制药中心提供。多聚赖氨酸和2%戊巴比妥钠(美国Sigma公司)，DMEM低糖培养基(美国Gibco公司)，羊抗兔IgG和兔抗大鼠Bcl-2、Bax (武汉博士德生物工程有限公司)，免疫组织化学试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，胎牛血清(浙江天杭科技股份有限公司)，胰酶(上海雅心生物技术有限公司)，Hank’s液(北京谱析公司)，PBS缓冲液(北京谱析公司)。CO2培养箱 (日本YAMATO公司)，离心机(日本Hitachi公司)，倒置荧光显微镜(德国Olympus公司)，培养皿、培养板和培养瓶(丹麦NUNCLON公司)，流式细胞仪(美国贝克曼公司)。

1.2 胎鼠脊髓细胞悬液的培养和制备 将雌雄大鼠按照1∶1的比例在每日晚约21时进行合笼，次日上午8时采用滴管轻触阴门口处，如发现有乳白色、固态胶状物即阴道栓，由于阴道栓阻塞阴道口而使滴管不能进入阴道内，可判定为阳性；否则为阴性。孕鼠另取笼饲养，连续3 d未见阴栓则弃用。取孕16 d大鼠，采用2%戊巴比妥钠(3 mg·kg-1腹腔注射)麻醉大鼠后，仰卧位固定，于超净工作台上无菌取出胎鼠。将胎鼠经Hank’s液冲洗后，于显微镜下操作完全剥离胎鼠皮肤及皮下组织，完全暴露椎管于镜下，再将椎管两侧呈楔形切开，剥离神经根，使脊髓完全暴露于视野中，并将脊髓组织分离出来。再次使用Hank’s液冲洗剥离出来的完整脊髓组织，在镜下剪成1 mm × 1 mm× 1 mm糜状碎块。在pH= 8、37℃环境下采用0.25%胰蛋白酶消化15 min，采用5 mL移液管吹打数次后以0.075 mm筛孔尺寸滤网过滤，离心弃上清，在培养瓶中放置DMEM低糖培养基，并加入10%胎牛血清以1 × 106mL-1接种。将培养瓶置于饱和湿度、恒温37℃、5%CO2培养箱中培养，每2～3 d更换培养基。

1.3 流式细胞术检测Aβ25-35诱导的脊髓神经元凋亡率 取处于对数生长期的脊髓神经元，经过0.125%胰蛋白酶消化，采用5 mL移液管吹打数次后收集，收集后采用1 000 r·min-1室温离心5 min，弃上清。将脊髓神经元置于完全培养基中重悬，等细胞浓度调整为1 × 106mL-1后接种于24孔板。待细胞融合至80%时，加入10 μmol·L-1Aβ25-35，作用48 h后吸尽培养液，以4% 多聚甲醛固定，得到实验所需细胞。4℃保存备用。镜下观察胎鼠脊髓神经元，悬液接种后初始脊髓神经元大多为圆形，诱导凋亡后细胞形态发生改变，计算细胞凋亡率。脊髓神经元凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.4 细胞分组 将培养细胞分为6组，即正常细胞组(正常脊髓神经元)、诱导凋亡组(Aβ25-35诱导凋亡后的脊髓神经元)、SCs组(Aβ25-35诱导凋亡后的脊髓神经元+SCs)、GDNF组(Aβ25-35诱导凋亡后的脊髓神经元+GDNF)、SCs+GDNF组(Aβ25-35诱导凋亡后的脊髓神经元+GDNF转染的SCs)和VAP联合组(Aβ25-35诱导凋亡后的脊髓神经元+VAP联合GDNF转染的SCs)。

1.5 免疫组织化学染色检测各组脊髓神经元中caspase-3阳性细胞数 将各组细胞置入24孔培养板上，采用甲醇固定10 min，采用37℃预热的0.1 mol·L-1PBS洗涤后再应用95%乙醇固定30 min，将一抗或二抗工作液稀释后滴加入其中，然后采用PBS洗涤3次，每次洗涤2 min再滴加适当由1%BSA-PBS稀释的生物素标记的二抗，37℃孵育10 min后冲洗复染、封片。免疫细胞化学染色结果在光镜下观察，诱导后有10%～30%细胞呈现棕色，强度不一，为阳性表达；诱导和未诱导细胞完全不显色为阴性表达。

2 结 果

2.1 各组脊髓神经元凋亡率 与正常细胞组比较，诱导凋亡组脊髓神经元凋亡率明显升高(P<0.05)；与诱导凋亡组比较，SCs组、GDNF组、SCs+ GDNF组和VAP联合组脊髓神经元凋亡率降低(P<0.05)；与SCs组比较，GDNF和SCs+GDNF组脊髓神经元凋亡率明显降低(P<0.05)；与SCs+ GDNF组比较，VAP联合组脊髓神经元凋亡率明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 共培养48 h后各组脊髓神经元凋亡率

GroupApoptotic rateNormal cell 10.32±1.32Induced apoptosis58.61±4.33*SCs 40.33±3.56△GDNF36.21±3.09△#SCs+ GDNF29.11±1.27△#VAP combination23.11±2.25△○

*P<0.05vsnormal cell group；△P<0.05vsinduced apoptosis group；#P<0.05vsSCs group;○P<0.05vsSCs+GDNF group.

2.2 各组脊髓神经元中caspase-3阳性细胞数 各组细胞中均有caspase-3表达，其中正常细胞组脊髓神经元中caspase-3阳性细胞数最少，细胞着色较淡；诱导凋亡组脊髓神经元中caspase-3阳性细胞数最多，细胞着色较深；VAP联合组脊髓神经元中caspase-3阳性细胞数较SCs组、GDNF组、SCs+ GDNF组减少，细胞着色差异明显；SCs组、GDNF组和SCs+ GDNF组细胞着色差异不大，caspase-3阳性细胞数相差不大，但与诱导凋亡组比较明显减少(P<0.05)。见图1(插页四)。

3 讨 论

SCI后可并发一系列病理改变，致使脊髓的损害加重，产生不同程度神经元坏死和组织变性等严重后果，最终导致神经功能异常或障碍。同时，由于中枢神经系统内神经营养因子缺乏，神经元的坏死与凋亡使得SCI后神经功能的恢复十分困难。GDNF是目前己知的神经营养因子中活性最强的运动神经营养因子[9]，由于GDNF相对分子质量偏大、半衰期又相对较短，其不能自由通过血脑屏障，所以GDNF 始终未能直接应用于临床。SCs可分泌多种神经营养因子，是周围神经系统的主要神经胶质细胞，能够有效促进神经元再生。研究[8，10]显示:GDNF 基因修饰的SCs可通过降低 Bax mRNA表达水平和提高 Bcl-2 mRNA表达水平，从而抑制脊髓神经元凋亡。本研究首先分离培养 SCs，其次应用基因技术将GDNF转染SCs，得到生物活性更强的SCs，最后采用VAP联合GDNF转染的SCs进行体外实验，观察VAP联合 GNDF 修饰的 SCs 对SCI的保护作用。

鹿茸具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任和托疮毒[11]的功能。研究[12-15]显示：鹿茸中含有各种细胞生长因子，其中VAP具有促进骨及软骨愈合、加速周围神经组织再生、促进软骨细胞和成纤维细胞的增殖等功能[16-18]。研究[19-20]显示：VAP可使 Bax表达水平下调和 Bcl-2表达水平上调，从而抑制神经元凋亡。本文作者发现：VAP联合GDNF转染的SCs可使Aβ25-35诱导凋亡的脊髓神经元中caspase-3表达下调，从而抑制脊髓神经元凋亡。

综上所述，本研究探讨VAP联合GDNF基因修饰的SCs对Aβ25-35诱导的脊髓神经元凋亡的保护作用，证实VAP联合GDNF基因修饰的SCs对脊髓神经元具有保护作用，为临床治疗SCI寻找了新途径，也为临床优化组织工程中种子细胞的研究提供了实验和理论依据。在未来研究中，本课题组将对本研究的结论进行更深入的论证。