错配修复基因蛋白在结直肠癌诊治中的临床应用*
2018-11-28邱春华张志宏董丹丹李良平
邱春华 张志宏 董丹丹 李良平
结直肠癌是中国常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率分别位居第3位和第5位[1-2]。研究发现,DNA错配修复基因(mismatch repair gene,MMR)的突变或甲基化,导致微卫星不稳定性(microsatellite instabili⁃ty,MSI),是结直肠癌发生的重要机制之一[3]。占结直肠癌3%~5%的Lynch综合征是由于MMR发生胚系突变所致的常染色体显性遗传性疾病。而在15%散发性结直肠癌中,错配修复基因MLH1启动子甲基化失活是其主要的发生机制,临床特征与Lynch综合征相似。2014年美国国家综合癌症网络(NCCN)推荐初诊结直肠癌患者应筛查Lynch综合征[3]。
本研究采用免疫组织化学法检测结直肠癌患者手术标本中MMR的表达情况,及其与临床病理学的关系,并评价其在Lynch综合征和散发性结直肠癌筛查中的价值,以期为临床筛查Lynch综合征提供简便、快速、经济的检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病例资料 选取四川省人民医院2015年1月至2016年9月收治的结直肠癌患者607例,均经术后病理确诊,其中男性376例(61.94%),女性231例(38.06%);年龄26~90岁,平均年龄63岁;排除术前接受过放化疗的患者。采用免疫组织化学LDP法检测切除的肿瘤组织标本中MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的表达和P53、VEGF、Ki-67、CD34、D2-40的表达情况,及与临床病理的关系。本研究获得四川省人民医院伦理委员会的批准[伦审(研)2018年第149号]。
1.1.2 主要试剂 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2,P53、VEGF、Ki-67、CD34、D2-40购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 实验方法 采用免疫组织化学LDP法。将患者手术切除的肿瘤标本,10%福尔马林固定,常规石蜡包埋,5 μm连续切片。按产品说明书操作,第一抗体分别为MLH1(鼠单抗,1:10)、MSH2(兔单抗,1:100)、MSH6(兔单抗,1:100)、PMS2(兔单抗,1:20)、P53(鼠单抗,1:100)、VEGF(兔多抗)、Ki-67(鼠单抗,1:100)、CD34(鼠单抗,1:100)、D2-40(鼠单抗,1:25),采用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照,MLH1、MSH2以正常结肠黏膜上皮表达情况作为阳性对照。MSH6、PMS2以结肠癌表达情况作为阳性对照。P53以乳腺癌表达情况作为阳性对照。VEGF以肝癌表达情况作为阳性对照。Ki-67、D2-40以扁桃体表达情况作为阳性对照。CD34以血管内皮表达情况作为阳性对照。
1.2.2 结果判定 结合染色强度和阳性细胞百分比进行判断[4],由两位病理科医生独立完成结果判定。
MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、P53、Ki-67蛋白均位于细胞核,VEGF蛋白定位于细胞质/细胞膜,CD34定位于血管内皮细胞的胞质。D2-40蛋白定位于淋巴管细胞质,呈黄色或棕黄色染色为表达(+),不着色为缺失(-)。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白中任意一种不表达判定为MMR表达缺失,而MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白均表达则判定为MMR完整。
1.2.3 随访 每3个月随访1次,门诊随访和电话随访相结合,根据患者的检查结果、治疗方案,观察总体生存和无瘤生存情况。随访时间为20~40个月,截至2018年4月。
1.3 统计学分析
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计数资料的比较采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 MMR在结直肠癌中的表达
607例标本中,共 216例 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表达缺失,MMR表达缺失率为35.58%。其中男性136例,女性80例,年龄≤50岁41例。将216例MMR蛋白表达缺失患者设为阴性组,391例表达正常患者设为阳性组,两组在肿瘤位置比较(左半结肠vs.右半结肠,直肠vs.右半结肠)差异具有统计学意义(P<0.01,表1),MMR蛋白阴性组右半结肠癌高发,阳性组左半结肠癌和直肠癌高发。两组年龄、性别比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。
表1 MMR蛋白在结直肠癌中的表达
2.1.1 MMR一项表达缺失结果 MMR一项表达缺失,分别以MLH1、PMS2蛋白表达缺失为主。MLH1蛋白表达缺失率为3.95%,表达缺失组右半结肠8例,左半结肠+直肠16例;表达阳性组右半结肠60例,左半结肠+直肠331例。两组在肿瘤位置的比较(左半结肠/直肠vs.右半结肠),差异具有统计学意义(P<0.05)。PMS2蛋白表达缺失率为11.04%,表达缺失组右半结肠17例,左半结肠+直肠50例;表达阳性组右半结肠60例,左半结肠+直肠331例。两组在肿瘤位置的比较(左半结肠/直肠vs.右半结肠),差异具有统计学意义(P<0.05)。MLH1蛋白、PMS2蛋白阴性组右半结肠癌高发,阳性组左半结肠癌和直肠癌高发。
2.1.2 MMR多项表达缺失结果 MMR联合两项表达缺失,以MLH1/PMS2联合表达缺失为主。MLH1/PMS2蛋白表达缺失率为14.50%,表达缺失组右半结肠49例,左半结肠+直肠39例;表达阳性组右半结肠60例,左半结肠+直肠331例。右半结肠癌MLH1/PMS2蛋白表达缺失率明显高于左半结肠癌和直肠癌(P<0.01)。MMR三项联合表达缺失 6例,MLH1、MSH2、PMS2、MSH6同时表达缺失4例。
2.2 MMR蛋白表达与临床病理学关系
MMR蛋白表达缺失的阴性组,高/中分化146例,低分化70例;表达正常的阳性组,高/中分化313例,低分化78例。两组在肿瘤分化程度(高/中分化vs.低分化)的比较,差异具有统计学意义(P<0.01,表2)。MMR蛋白表达缺失的阴性组,Ⅰ/Ⅱ期87例,Ⅲ期129例;表达正常的阳性组,Ⅰ/Ⅱ期190例,Ⅲ期201例。两组TNM分期(Ⅰ/Ⅱvs.Ⅲ)比较,差异具有统计学意义(P<0.05,表2)。MMR蛋白表达缺失的阴性组,有淋巴结转移67例,无淋巴结转移149例;表达正常的阳性组,有淋巴结转移199例,无淋巴结转移192例。两组淋巴结转移比较,差异具有统计学意义(P<0.01,表2)。两组肿瘤大小比较,差异无统计学意义(P>0.05)。两组肿瘤病理类型的比较显示,与黏液/印戒分化无关,与淋巴细胞浸润无关,差异均无统计学意义(P>0.05)。
表2 MMR蛋白在结直肠癌中的表达与病理学关系
2.3 P53、VEGF、Ki-67、CD34、D2-40在结直肠癌中的表达
MMR蛋白表达缺失的阴性组,VEGF阳性152例,阴性64例;表达正常的阳性组,VEGF阳性334例,阴性57例,两组比较差异具有统计学意义(P<0.01,表3)。MMR蛋白表达缺失的阴性组,Ki-67在1%~50%有97例,51%~100%有119例;表达正常的阳性组,Ki-67在1%~50%有132例,51%~100%有259例,两组比较差异具有统计学意义(P<0.01,表3)。左半结肠癌和直肠癌的VEGF、Ki-67表达水平高于右半结肠癌。MMR蛋白表达缺失的阴性组和表达正常的阳性组P53、CD34、D2-40的比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。
表3 VEGF、Ki-67在结直肠癌中的表达
3 讨论
2017年中国癌症数据报告显示结直肠癌的发病率呈明显上升趋势,分别位居男性肿瘤发病率的第4位,女性的第3位,城市年发病率高达33.17/10万人[1-2,5]。有研究发现,MMR突变或甲基化导致的MSI,是结直肠癌发生的重要机制之一[3]。本研究在MMR蛋白表达缺失中分别以MLH1、PMS2、MLH1/PMS2蛋白表达缺失为主,提示MMR蛋白表达阴性组右半结肠癌高发,阳性组左半结肠癌和直肠癌高发。右半结肠癌和左半结肠癌在胚胎来源、分子特征、致癌机制等方面存在差异。右半结肠癌与MMR缺失、MSI阳性表达、MLH1基因甲基化、BRAF基因突变等相关,左半结肠癌与抑癌基因APC、P53等的失活、KRAS基因突变相关[6]。
发病部位为MLH1/PMS2蛋白表达的独立影响因素。若MLH1/PMS2蛋白缺失,可进一步安排BRAF V600E突变和MLH1启动子区甲基化的检测,如结果为阴性应进行MLH1/PMS2基因种系突变检测,根据结果确定是否为Lynch综合征[7-8]。本研究两组患者在肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移方面比较,差异均有统计学意义。术后定期随访发现,MMR蛋白表达缺失的阴性组,复发转移8例,死亡2例;MMR蛋白表达正常的阳性组,复发转移21例,死亡7例。有研究提示发病部位、TNM分期是MMR蛋白表达的独立影响因素[9]。MMR蛋白表达缺失的结直肠癌有其独特的生物学行为特征,中国多项研究发现,肿瘤多位于右半结肠,肠外恶性肿瘤发病率较高,低分化腺癌常见,肿瘤预后好于散发性大肠癌[7,10]。家族史、低龄、右半结肠肿瘤、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期、肿瘤侵入固有肌层为中国可疑Lynch综合征患者的高危临床病理学因素[11]。
本研究两组患者VEGF、Ki-67的比较,差异具有统计学意义,远端结肠和直肠癌的VEGF表达水平高于近端结肠癌。肿瘤原发部位基因表达和突变的差异,影响化疗和分子靶向药物的效果,导致左、右半结肠癌患者的预后不同[12]。抗血管生成抑制剂贝伐珠单抗靶向治疗的疗效和部位存在明显关系,根据原发瘤部位选择结直肠癌靶向治疗,对现有治疗方案选择产生深远影响[5]。Bendardaf等[13]研究显示,在CAPEOX+贝伐珠单抗治疗的患者中,与盲肠和升结肠癌比较,乙状结肠和直肠癌的中位无进展生存时间和生存时间显著延长。有研究发现,P53参与腺瘤-癌变途径,可能仅对左半结肠癌有预后价值[14]。
Lynch综合征占结直肠癌的3%~5%,是MMR发生胚系突变所致的常染色体显性遗传性疾病,具有患癌风险明显增加、加速的癌变进程、发病年轻化等特点,需要与散发性结直肠癌鉴别[10]。对结直肠癌患者手术标本进行MMR的检测,可以筛查Lynch综合征患者和家族成员,避免漏诊。近期国内外指南和共识推荐结直肠癌患者进行MMR免疫组织化学或MSI的检测,筛查Lynch综合征[3,7]。MMR的检测对外科决策较为重要,对于年轻的Lynch综合征相关结直肠癌患者,推荐扩大结肠切除范围[15]。在15%散发性结直肠癌中,MLH1启动子甲基化失活是其主要的发生机制,临床特征与Lynch综合征相似,肿瘤多位于右半结肠,病理分期以Dukes B期为主,病理形态以隆起型多见,MLH1表达缺失率高于MSH2等,需要与Lynch综合征鉴别[3,7]。
MMR在Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌患者中可作为预后较好的生物学标志物[16]。某一MMR基因突变所导致的微卫星不稳定增高(MSI-H),预示对氟尿嘧啶化疗缺乏敏感性,不能从中受益[17]。结直肠癌的免疫治疗中,dMMR/MSI-H是预测抗PD-1单抗疗效的标志物。2017版NCCN指南中首次将免疫检查点抑制剂PD-1单抗pembroli⁃zumab和nivolumab推荐用于具有dMMR/MSI-H分子表型的结直肠癌的末线治疗[18]。MMR基因突变检测为Lynch综合征诊断的“金标准”,但因费用较贵限制了其临床应用。患者的手术标本先进行MMR免疫组织化学法检测,根据结果再确定是否进行基因种系突变的检测[19]。一项回顾性研究显示,免疫组织化学联合检测MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白缺失的敏感度为77%~100%,特异性为98%~100%,与MSI检测相当[20]。另一项系统回顾研究表明,在结直肠癌患者中筛查Lynch综合征,MSI检测的敏感度为66.7%~100.0%,特异性为61.1%~92.5%。免疫组织化学法检测的敏感度为80.8%~100.0%,特异性为80.5%~91.9%。两种检测方法均可较好地用于Lynch综合征的筛查[19]。因此,免疫组织化学法检测可作为MMR缺失分析的首选筛选方法,达到初步筛选Lynch综合征患者的目的[20]。
综上所述,MMR蛋白检测的应用,为结直肠癌患者及时筛查发现、治疗及随访Lynch综合征相关恶性肿瘤提供了简便有效的方法,由此可降低患癌的风险,不断提高人类健康水平。