加热温度和时间对真空低温烹饪鸡胸肉脂肪与蛋白质氧化的影响

李梦琪，孙思远，刘 敏，陈瑞霞，相 悦，徐世明，孙承锋,*

（1.烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005；2.烟台市喜旺食品有限公司，山东 烟台 264002）

真空低温烹饪是一种将食材真空包装后置于较低的温度条件下进行较长时间加热的一种食品加工方式，加热温度通常在60～90 ℃之间，加热时间最长可达48 h。真空低温烹饪最早应用于鹅肝的制作中，成功降低了鹅肝烹饪过程中的水分损失[1]。相对于传统的烹饪方式，真空包装可减少营养成分和水分的流失并防止二次污染，温度和时间的精确控制能最大限度保持食品的色香味，这一新型烹饪方式越来越受到人们的欢迎[2]。目前，国内外已有将真空低温烹饪方式应用于肉类、水产品、蔬菜和水果处理的研究报道[3-5]。

加热温度和时间是影响真空低温加工品质的2 个重要因素[5]，尽管真空低温加热过程中产品几乎处于无氧状态，但随着加热时间的延长，食品中存在的氧自由基仍然可以引起脂肪氧化。蛋白质在加热过程中不仅可以接受活性氧进而发生氧化，还可以间接和脂肪氧化产物发生氧化反应，这都将引起蛋白质理化性质的改变，从而影响肉制品的营养、风味和口感[6-7]。目前，有关真空低温加热工艺参数对肉类品质影响的研究很少，仅有少量真空低温加热牛肉、羊肉的相关报道，Roldan[8]、Kumari[9]等分别对真空低温烹饪羊肉和牛肉进行研究，均发现时间和温度对蛋白质和脂肪氧化有显著影响。肉类的化学组成不同，加热过程中的化学反应有很大差异，所采用的加工温度和时间也有所差异，对于鸡肉的真空低温加热，可参考的数据有限。鸡肉是我国增长速度快且需求量大的肉类，随着快餐业的飞速崛起和即食产品的出现和推广，真空低温加热鸡肉的处理方式将有广阔的应用前景[10]。

本研究以鸡胸肉为研究对象，在不同温度（65、75、85 ℃）和时间（2、6、14 h）条件下对鸡胸肉进行真空低温烹饪，分析探究不同的温度-时间组合下真空低温烹饪鸡胸肉中脂肪氧化与蛋白质氧化的变化规律，确定适宜的烹饪条件，为真空低温烹饪技术在鸡肉产品开发中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选择某品牌鸡胸肉为原材料，购于烟台新世界百货超市。

2-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA，生化试剂） 天津市致远化学试剂有限公司；2,4-二硝基苯肼（生化试剂） 天津市光复科技发展有限公司；硫代硫酸钠（分析纯）、邻苯二甲酸氢钾（分析纯）、乙二胺四乙酸（分析纯）、5,5’-二硫代双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）（生化试剂）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylenebis（oxyethylenenitrilo）tetraacetic acid，EGTA）（生化试剂）、脲（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DZ-300真空包装机、DHG-9076A恒温鼓风干燥箱江阴市保利科研器械有限公司；WFZ UV-2000紫外分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；DF-101Z恒温加热磁力搅拌器 河南省予华仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；J-26XP冷冻离心机 美国贝克曼公司。

1.3 方法

将鸡胸肉贮藏于（-18±1） ℃的冰箱中备用，使用前将冷冻的鸡胸肉进行流水解冻，用去离子水冲洗干净，用干净的白纱布轻轻拭去表面水分，并且除去鸡胸肉表面多余的脂肪，切成平均厚度为1 cm的肉块，放入食品级包装袋中抽真空。依次放入设定好不同温度（65、75、85 ℃）和时间（2、6、14 h）的恒温水浴加热。

1.3.1 共轭二烯烃过氧化物（conjugated diene hyperoxide，CDHP）含量的测定

参照Juntachote等[11]的方法。

1.3.2 TBA值的测定

称取10 g绞碎混匀的鸡肉样品，置于锥形瓶中，加入50 mL 7.5%的三氯乙酸溶液（含0.1%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）），振荡40 min后，双层滤纸过滤2 次；吸取5 mL上清液，加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，于90 ℃水浴加热50 min，冷却离心；取上清液，加入5 mL氯仿并摇匀，静置分层后取上清液，分别于532、600 nm波长处测定吸光度。

1.3.3 酸价（acid value，AV）的测定

参照GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》[12]。

1.3.4 蛋白质羰基含量的测定

1.3.4.1 肌原纤维蛋白提取

称取10.00 g样品，与缓冲液A（20 mmol/L磷酸盐缓冲液，含有100 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA，pH 7.0）混合，振荡混匀（样品的质量浓度为10 g/100 mL），匀浆后于6 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min；取沉淀，加入5 倍体积（m/V）缓冲液A，相同条件下离心取沉淀；重复以上操作2 次，最后向沉淀中加入缓冲液B（25 mmol/L磷酸盐缓冲液，含有0.6 mol/L NaCl，pH 7.0），匀浆后冰浴溶解，过滤去除不溶性部分，滤液即为肌原纤维蛋白溶液。以牛血清蛋白（盐酸胍溶解）为标准，在280 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，双缩脲法测定蛋白质浓度，并用缓冲液调节蛋白浓度。

1.3.4.2 羰基含量的测定

参照Oliver等[13]的方法，并略加改动。取2 mL质量浓度约为5.0 mg/mL的蛋白溶液，置于离心管中，每管中加入2 mL 10 mmol/L的2,4-二硝基苯肼（对照组加入2 mol/L的HCl，其余操作相同），室温下黑暗处静置1 h（每隔10 min涡漩1 次）；然后加入2 mL质量分数20%的三氯乙酸，10 000 r/min条件下离心15 min，弃上清液；用2 mL乙酸乙酯-乙醇（1∶1，V/V）洗涤沉淀3 次，去除未反应的试剂，加入5 mL盐酸胍溶液（6 mol/L，溶于20 mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 6.5），37 ℃条件下溶解沉淀20 min，10 000 r/min条件下离心5 min，去除不溶性部分。测定370 nm波长处的吸光度，摩尔吸光系数为21 000/（L/（mol·cm）），羰基含量表示为mmol/kg肉[14-15]。

1.3.5 蛋白质巯基含量的测定

称取0.5 g鸡肉样品，加入10 mL 0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液，均质30 s；取均质后的匀浆1 mL，加入9 mL 0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液（含有0.6 mol/L NaCl、6 mmol/L EDTA和8 mol/L尿素），并在5 ℃、14 000×g条件下离心15 min；取上清液3 mL，加入0.04 mL的0.01 mol/L DTNB+0.05 mol/L醋酸钠溶液，40 ℃水浴15 min。用0.05 mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液（含有0.6 mol/L NaCl、6 mmol/L EDTA和8 mol/L尿素）作为空白，在412 nm波长处测定吸光度，巯基含量表示为mmol/kg肉[16]。

1.4 数据处理

每个实验重复3 次，用单因素方差分析对所得实验数据进行分析，设置显著性水平为P＜0.05，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同温度-时间组合对真空低温烹饪鸡胸肉CDHP含量的影响

由图1可知，烹饪温度（P＜0.05）和时间（P＜0.05）对真空低温烹饪鸡胸肉的CDHP含量均有显著影响。在65 ℃加热时，鸡胸肉的CDHP含量增长较缓慢（经过14 h后，从烹饪前的0.51 mmol/kg增加至0.67 mmol/kg）；75 ℃加热时，鸡胸肉的CDHP含量增长明显（从0.51 mmol/kg增加至0.74 mmol/kg）；然而，当加热温度达到85 ℃时，随着烹饪时间的增加，鸡胸肉的CDHP含量急剧增长，14 h时的CDHP含量接近初始值的5 倍，是同一烹饪时间下65 ℃加热时的4 倍。CDHP生成于脂肪氧化的初始阶段，在不饱和脂肪酸侧链氧化的过程中往往伴随着CDHP的形成。因此，CDHP是评价早期脂肪氧化程度的一个重要指标[17]。随着加热时间的延长和加热温度的增加，CDHP含量也在不断增长。Andreo等[18]研究温度对牛肉、猪肉制成的混合肉制品中CDHP含量的影响以及Juntachote等[11]研究80 ℃时猪肉中CDHP的含量随时间变化的规律时也均得到了类似的结果。

图1 不同温度-时间组合下真空低温烹饪鸡胸肉的CDHP含量Fig.1 CDHP content in sous-vide cooked chicken breast at different temperature-time combinations

2.2 不同温度-时间组合对真空低温烹饪鸡胸肉TBA值的影响

图2 不同温度-时间组合下真空低温烹饪鸡胸肉的TBA值Fig.2 TBA value in sous-vide cooked chicken breast at different temperature-time combinations

由图2可知，真空低温烹饪鸡胸肉的TBA值在烹饪起始阶段呈上升趋势，并且在65、75 ℃加热时，TBA值的上升速率明显高于85 ℃。随着烹饪时间的延长，鸡胸肉的TBA值出现下降趋势，其中75 ℃加热时的TBA值下降速率明显大于65、85 ℃。与CDHP不同，TBA值与脂肪氧化的次级产物有关，加热常常会引起TBA值的升高。Conchillo等[19]研究不同烹饪方式下TBA值的变化情况，结果表明，不同的加工方式均会引起TBA值的上升。随着烹饪时间的延长，TBA值出现下降趋势，这是由于加热温度的增加和时间的延长使脂肪氧化分解，其最终产物丙二醛（malonaldehyde，MDA）十分容易与肉制品中其他含有氨基的物质发生反应，如蛋白质、磷脂类物质、DNA和氨基酸[20-21]，导致MDA含量下降，从而使TBA值降低，这一结果与Sanchez等[22]的研究结论相符。

2.3 不同温度-时间组合对真空低温烹饪鸡胸肉AV的影响

图3 不同温度-时间组合下真空低温烹饪鸡胸肉的AVFig.3 AV in sous-vide cooked chicken breast at different temperaturetime combinations

AV表示样品中游离脂肪酸的总量，是衡量脂肪腐败变质的一个重要指标，肉制品中的游离脂肪酸主要来自于脂肪的水解和氧化，游离脂肪酸越多，酸价就越高[23]。由图3可知，在烹饪过程中，随着加热时间的延长，真空低温烹饪鸡胸肉样品的AV呈不断上升的趋势。随着加热时间的延长，脂肪不断水解，生成的游离脂肪酸不断增多，造成AV的不断上升。在烹饪的前期阶段，随着加热时间的延长，鸡胸肉AV的上升速率较快（P＜0.05）；加热2 h以后，AV的上升速率明显降低。在相同加热时间时，随着温度的升高，AV上升速率越来越快（P＜0.05），可以明显看出，75、85 ℃加热时的AV远远大于65 ℃加热时，说明温度越高，脂肪的水解速率越快，AV越高[24-25]。

2.4 不同温度-时间组合对真空低温烹饪鸡胸肉蛋白质羰基含量的影响

图4 不同温度-时间组合下真空低温烹饪鸡胸肉的蛋白质羰基含量Fig.4 Protein carbonyl content in sous-vide cooked chicken breast at different temperature-time combinations

由图4可知，加热的温度和时间对真空低温烹饪鸡胸肉的蛋白质羰基含量有显著影响（P＜0.05）。加热温度相同时，随着加热时间的延长，鸡胸肉的蛋白质羰基含量均呈现不断上升的趋势；加热到14 h时，鸡胸肉中蛋白质的羰基含量接近烹饪之前的5 倍。Adeyemi等[26]研究表明，热加工可以引起蛋白质羰基含量的急剧上升。随着时间的延长，蛋白质羰基含量最后慢慢趋于一致。造成蛋白质羰基含量增加的原因可能是脂肪过氧化反应产生的自由基使蛋白质变性，氨基酸对超氧阴离子自由基的攻击非常敏感，尤其是侧链上带有-NH或-NH2的氨基酸对羟自由基更为敏感，这些敏感基团被自由基攻击，转化成羰基基团，从而导致羰基含量的增加[27-28]；并且脂质氧化产生小分子酸、酮类活泼物质，可能使蛋白质分子内的化学键被破坏，肽骨架发生断裂。从上文的研究结果可知，随着时间的延长，鸡胸肉中的脂肪不断被氧化，脂肪的氧化间接促进了蛋白质的氧化。Promeyrat等[29]研究45～90 ℃加热条件下蛋白质羰基含量的变化趋势，发现温度对其影响甚微。然而，Gatellier等[30]的研究指出，温度对蛋白质羰基含量的影响有促进作用，但是这种促进作用在达到60 ℃时就不再明显；而且该研究中样品的加热时间只有300 s，而本研究的烹饪时间已经达到14 h，加热温度远高于60 ℃。由此推断，在烹饪开始的最初阶段，蛋白质的羰基含量随着加热时间的延长和加热温度的升高急剧升高，而到达某一个时间以后，变化不再明显，但是随着加热时间的延长，蛋白质氧化在不断进行，蛋白质羰基含量仍在不断增加[28]。

2.5 不同温度-时间组合对真空低温烹饪鸡胸肉蛋白质巯基含量的影响

图5 不同温度-时间组合下真空低温烹饪鸡胸肉的蛋白质巯基含量Fig.5 Protein sulfydryl content in sous-vide cooked chicken breast at different temperature-time combinations

巯基又称作活性巯基，其含量的变化能够反映出蛋白质变性的程度。由图5可知，烹饪的温度和时间对真空低温烹饪鸡胸肉的蛋白质巯基含量有显著影响（P＜0.05），均随着温度和时间的延长而下降，其中烹饪最初阶段巯基含量的下降速率最快，85 ℃加热条件下烹饪14 h时的含量最低，接近未烹饪时的1/2。这主要是由于埋藏在蛋白质结构内部的疏基因氧化而暴露于蛋白质表面，蛋白质表面的活性疏基容易发生氧化，转化为氧化衍生物（即二硫键），从而改变蛋白质的天然构象，导致蛋白质变性，促进蛋白质氧化，导致营养价值损失[29-30]。Santé-Lhoutellier等[31]研究发现，热处理后的牛肉中游离巯基含量降低，并认为这一现象可能对肉中蛋白质的氧化有显著影响；此外，半胱氨酸游离巯基含量的下降与蛋白质的氧化程度和肉及肉制品的质量变化显著相关。Silva等[32]将真空低温烹饪与其他烹饪方式进行对比，发现真空低温烹饪鸡肉的游离巯基基团含量显著降低，表明鸡肉中的半胱氨酸比芳香族氨基酸更容易受到长时间加热的影响。

3 结 论

烹饪的温度和时间对真空低温鸡胸肉的脂肪氧化和蛋白质氧化均有显著影响（P＜0.05）。在65 ℃加热6 h的条件下，鸡胸肉的CDHP含量和AV均处于较低水平；加热温度相同时，随着加热时间的延长，鸡胸肉的CDHP含量均呈增长趋势，当温度达到85 ℃时，CDHP含量的增长最为显著；TBA值在烹饪的起始阶段呈上升趋势，并且65、75 ℃加热时，TBA值的上升速率明显大于85 ℃加热时，从加热6 h到14 h，鸡胸肉的TBA值不断下降，其中75 ℃加热时TBA值的下降速率明显大于65、85 ℃；鸡胸肉的AV随着加热时间的延长呈不断上升的趋势；65 ℃加热2 h条件下，鸡胸肉的蛋白质羰基和巯基含量均处于较低水平，随着加热时间的延长，蛋白质羰基含量出现不断上升的趋势，巯基含量随着温度和时间的延长而下降。综上所述，随着加热时间的延长和温度的升高，真空低温鸡胸肉的氧化程度不断加深。因此，在货架期及食用品质标准的允许范围内，建议使用较短时间和较低温度加工真空低温鸡胸肉。