1-脱氧野尻霉素对秀丽隐杆线虫的抗衰老作用

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(1.南京师范大学生命科学学院,江苏南京 210023; 2.南京野生植物综合利用研究院,江苏南京 211100)

机体氧化衰老在自然界是不可逆的,人体氧化衰老机制非常复杂。同时,由于化学药物不良反应多、靶点专一、多耐药性,使其防氧抗衰的科学性具有一定的争议。天然药物的历史悠久,是药物先导化合物及合成药物的重要来源,毒副作用小、作用广泛持久,随着科学技术的发展,天然药物的实验研究越来越多,药理药效逐渐明确,因此对于天然药物的研究开发已经成为目前人们关注的焦点。

1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)作为一种天然糖结构类似物,广泛存在于桑树及其它植物和微生物中,化学名为3,4,5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶,为高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂[1]。近年来国内外学者的研究表明,DNJ具有降血糖[2]、抗病毒[3]、抗肿瘤[4-5]以及调节血脂和影响脂肪代谢[6-8]的作用;王兴婷[9]等研究发现,桑叶DNJ提取物在体外对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用;王玲[10]等通过小鼠体内灌胃实验发现,适量DNJ可增强小鼠机体抗氧化能力,预防脂代谢异常等。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)作为一种模式生物,其结构简单、生命周期短、与人类基因保守性较高,广泛应用于抗衰老、药物筛选和神经系统疾病等各方面的研究[11-12]。本实验借助这一模式生物,进一步研究1-脱氧野尻霉素体内抗衰老作用及其机制,探究1-脱氧野尻霉素对生物体的影响,为桑科植物高值高效利用,开发抗氧化、降低血糖血脂等功能性食品提供重要的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

秀丽隐杆线虫野生型N2、突变体daf-2及突变体daf-16、大肠杆菌菌株E.coliOP50(尿嘧啶缺陷型) 均由南京野生植物综合利用研究院提供;氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠 南京化学试剂有限公司;多聚蛋白胨、磷酸钾、氯化钙、七水硫酸镁、胆固醇、酵母抽提物、二甲亚砜、次氯酸钠 国药集团化学试剂有限公司;琼脂、多聚蛋白胨 日本制药株式会社;DNJ标准品(纯度≥98%) 上海源叶生物科技有限公司;超氧化物歧化酶测试盒、过氧化氢酶测试盒 南京建成生物工程研究所。

SPX-150B-Z型生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;BG-50隔水式培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;BCD-183A冰箱 合肥荣事达电冰箱有限公司;JW-25017HR高速冷冻离心机 安徽嘉文仪器装备有限公司;HCB-1300V洁净工作台 青岛海尔特种电器有限公司;奥林巴斯显微镜(OlympusBX41) 南京艾朗仪器有限公司;JSZ6系列连续变倍体视显微镜 江南永新光学有限公司;MQT-60R摇床 上海旻泉有限公司;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;移液枪 上海艾研生物科技有限公司;紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;酶标仪 赛默飞世尔仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 NGM固体培养基配制 秀丽隐杆线虫生长培养基(NGM):取975 mL蒸馏水溶解3 g氯化钠,17 g琼脂粉,2.5 g多聚蛋白胨,高压蒸汽灭菌。待冷却至55 ℃左右后,加入1 mL 1 mol/L氯化钙,1 mL 1 mol/L硫酸镁,1 mL 5 mg/mL胆固醇,25 mL磷酸钾缓冲液。混匀后倒入无菌培养皿[13]。

1.2.2 秀丽隐杆线虫同步化 秀丽隐杆线虫体内出现大量虫卵时,在培养基上加入适量的M9缓冲液,将秀丽隐杆线虫洗脱收集至灭菌后的1.5 mL离心管,加入1 mL秀丽隐杆线虫裂解液(10%次氯酸∶1 mol/L氢氧化钠=1∶1),4000 r/min,离心1 min;去除裂解液,用M9缓冲液洗涤三次(4000 r/min,离心1 min),将底层的虫卵用移液枪吸出,涂在含有直径1 cm的大肠杆菌OP50的培养基上,20 ℃培养48～60 h,得年轻成虫[13]。

1.2.3 秀丽隐杆线虫暴露方法 将同步化后的秀丽隐杆线虫转移到含有大肠杆菌OP50的新鲜培养基中,对照组加入M9缓冲液,暴露组分别加入10、100、1000 mg/L DNJ,20 ℃处理24 h,进行后续实验。

1.2.4 DNJ对秀丽隐杆线虫寿命的影响 随机挑取暴露后的秀丽隐杆线虫至含有大肠杆菌OP50的培养基上,每组33条,每组设3个平行,20 ℃培养,同时设对照组。从转移当天(寿命实验第0 d)起计算线虫存活天数,并每天记录秀丽隐杆线虫存活和死亡条数,实验持续至最后一条秀丽隐杆线虫死亡为止,以铂金丝碰触秀丽隐杆线虫仍然不动即判定为死亡。根据线虫生存、死亡的条数绘制曲线,实验重复三次[14-15]。

1.2.5 DNJ对秀丽隐杆线虫运动能力的影响 身体弯曲频率测定:随机挑取暴露后的秀丽隐杆线虫至没有食物的NGM培养基上观察其身体弯曲频率,观察前先让秀丽隐杆线虫自由运动1 min,在显微镜下观察并记录1 min内秀丽隐杆线虫的身体弯曲次数,作为身体弯曲频率的指标,每组取20条观察,同时设对照组。1次弯曲定义为秀丽隐杆线虫相对于身体长轴方向上的一个波长移动,实验重复三次。

头部摆动频率测定:随机挑取暴露后的秀丽隐杆线虫至含M9缓冲液的空白培养基上,观察其头部摆动频率,观察前先让秀丽隐杆线虫自由摆动恢复1 min,在显微镜下观察并记录1 min内秀丽隐杆线虫的头部摆动次数,作为头部摆动频率的指标,每组20条观察,同时设对照组。1次头部摆动定义为其头部摆动方向改变,改变必须转过其身体朝向方向,实验重复三次[16]。

1.2.6 DNJ对秀丽隐杆线虫吞咽频率的影响 随机挑取20条暴露后的秀丽隐杆线虫至涂有大肠杆菌OP50的培养基上,同时设对照组,观察其吞咽频率,在奥林巴斯高倍显微镜下，观察并记录1 min内秀丽隐杆线虫的吞咽次数,作为秀丽隐杆线虫吞咽频率的指标,实验重复三次[16]。

1.2.7 DNJ对秀丽隐杆线虫排泄周期的影响 随机挑取20条暴露后的秀丽隐杆线虫至涂有大肠杆菌OP50的培养基上,同时设对照组,将每条秀丽隐杆线虫取出检测,当秀丽隐杆线虫体壁肌肉伸缩排泄到下一次体壁伸缩排泄的周期时间即为排泄周期,在奥林巴斯高倍显微镜下观测其排泄周期,实验重复三次[17]。

1.2.8 DNJ对秀丽隐杆线虫热激反应的影响 将暴露后的秀丽隐杆线虫放置35 ℃条件下培养6 h,然后随机挑取33条秀丽隐杆线虫至含有大肠杆菌OP50的培养基上,每板33条,每组设3个平行,20 ℃培养。从转移当天(寿命实验第0 d)起计算秀丽隐杆线虫存活天数,并每天记录秀丽隐杆线虫存活和死亡条数,实验持续至最后一条秀丽隐杆线虫死亡为止,以铂金丝碰触秀丽隐杆线虫仍然不动即判定为死亡。根据秀丽隐杆线虫生存的条数绘制曲线,实验重复三次[18]。

1.2.9 DNJ对秀丽隐杆线虫肠道活性氧(ROS)水平的影响 秀丽隐杆线虫肠道内ROS水平分析参考文献[19-20]方法采用荧光探针DCFH-DA(2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐)检测秀丽线虫体内的氧自由基水平。对照组与暴露组秀丽隐杆线虫分别被转移到含有20 μmol/mL DCFH-DA的M9缓冲液中20 ℃孵育4 h,然后转移到2%琼脂糖载玻片上,利用奥林巴斯荧光显微镜拍照记录。对所激发的荧光强度进行半定量分析,其荧光的强弱反映了体内ROS水平。每个浓度处理50条线虫,实验重复三次。

1.2.10 DNJ对秀丽隐杆线虫抗氧化酶活力水平的影响 准确称取对照组与处理组秀丽隐杆线虫全部组织质量,按质量/体积1∶12 (g/mL)的比例,加入12倍体积的生理盐水,冰水浴条件下手动匀浆,2500 r/min,离心10 min,取上清液100 μL稀释2倍待测;各组秀丽隐杆线虫超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力的测定分别严格按照南京建成生物工程研究所生产试剂盒说明书要求进行[21]。

1.3 数据处理

所有数据均为平均值±标准误差(S.E.M)。柱形图用Microsoft Excel软件绘制。数据分析使用SPSS 12.0软件完成。不同组别之间使用方差分析(ANOVA)。概率水平0.05与0.01代表统计分析上的显著性差异。寿命试验运用2尾检验中的两样本T-检验。

2 结果与分析

2.1 DNJ合适浓度的筛选

2.1.1 DNJ对秀丽隐杆线虫体内抗氧化酶活力的影响 抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等。SOD对机体的氧化与抗氧化水平起着至关重要的作用,能清除超氧阴离子自由基,保护机体免受损伤;CAT能有效清除各种活性氧基团,从而防止这些基团对细胞膜系统的破坏。秀丽隐杆线虫体内抗氧化酶活力增强,则秀丽隐杆线虫的抗氧化能力增强。如图1所示,与对照组相比,10、100、1000 mg/L DNJ处理的秀丽隐杆线虫的SOD、CAT活力均极显著增强(p<0.01),由此说明DNJ能够增强秀丽隐杆线虫的抗氧化作用。其中,SOD活力与DNJ呈剂量相关性,而100 mg/L DNJ处理的秀丽隐杆线虫CAT活力明显高于1000 mg/L DNJ处理的秀丽隐杆线虫CAT活力,可能由于药物浓度过高,导致秀丽隐杆线虫出现机体损伤,抗氧化能力减弱。

图1 不同浓度DNJ对秀丽隐杆线虫体内抗氧化酶活性的影响Fig.1 The activity of antioxidant enzyme of the C.elegans treated with different concentrations of DNJ注:与对照组相比,*表示差异显著(p<0.05),**表示差异极显著(p<0.01)。图3～图6、图9～图12同。

2.1.2 DNJ对体内肠道ROS水平的影响 肠道ROS富集对有机体极其有害,当ROS水平超出防御机制所及范围,细胞就处于氧化胁迫状态,引发脂质过氧化、蛋白质氧化、核酸损伤和酶失活,并能激活程序性细胞死亡[22-23]。荧光探针DCFH-DA与ROS结合,若结合程度越高,荧光强度就越亮,则肠道内ROS含量越高,反之,若结合程度越低,荧光强度就越暗,则肠道内ROS含量越低。如图2所示,与对照组相比,10、100、1000 mg/L DNJ处理的秀丽隐杆线虫随浓度增大荧光强度越来越暗,说明秀丽隐杆线虫随DNJ浓度增大,脂质过氧化程度越来越弱。因此,10、100、1000 mg/L DNJ均能够降低秀丽隐杆线虫肠道内ROS水平,提高秀丽隐杆线虫的抗氧化能力。

图2 不同浓度DNJ对秀丽隐杆线虫肠道活性氧水平的影响Fig.2 The intestinal active oxygen level of the C.elegans treated with different concentrations of DNJ

2.1.3 DNJ对秀丽隐杆线虫寿命的影响 寿命是秀丽隐杆线虫经样品处理前后变化最直接的反映,如图3所示,与对照组相比,10、100 mg/L DNJ能够显著延长秀丽隐杆线虫的寿命和半数死亡时间(p<0.05),但1000 mg/LDNJ则显著缩短了秀丽隐杆线虫的寿命和半数死亡时间(p<0.05),这可能由于,药物浓度过高对秀丽隐杆线虫机体损伤所致。在抗氧化酶活力测定时发现,1000 mg/L DNJ处理秀丽隐杆线虫的CAT活力较100 mg/LDNJ处理的CAT活力也有所下降,因此综上三项评价指标,后续实验DNJ浓度确定为:10、100 mg/L。

图3 不同浓度DNJ对秀丽隐杆线虫寿命的影响Fig.3 Lifespan of C.elegans treated with different concentrations of DNJ

2.1.4 DNJ对秀丽隐杆线虫运动能力的影响 运动行为常常被作为反映神经系统基本功能的指标,可以用来评价秀丽隐杆线虫在样品处理前后神经系统功能是否发生改变。常采用头部摆动和身体弯曲两个表型指标来评价运动行为能力。如图4所示,与对照组相比,10、100 mg/L的DNJ处理组秀丽隐杆线虫,身体弯曲和头部摆动均极显著增强(p<0.01),因此10、100 mg/L的DNJ均能极显著提高秀丽隐杆线虫的运动行为能力,降低秀丽隐杆线虫的机体氧化,保护神经系统功能。

图4 不同浓度DNJ对秀丽隐杆线虫运动行为的影响Fig.4 Behavior of C.elegans treated with different concentrations of DNJ

2.1.5 DNJ对秀丽隐杆线虫排泄周期的影响 排泄周期是评价秀丽隐杆线虫抗氧化的重要指标,秀丽隐杆线虫生长状态越好,其代谢能力越强,排泄周期越短。如图5所示,与对照组相比,10、100 mg/L的DNJ处理组的秀丽隐杆线虫,排泄周期极显著缩短(p<0.01),代谢能力随DNJ浓度增加而增强,因此10、100 mg/L的DNJ能够维持秀丽隐杆线虫代谢能力,提高机体抗氧化水平。

图5 DNJ对秀丽隐杆线虫排泄周期的影响Fig.5 Defecation cycle of C.elegans treated with different concentrations of DNJ

2.1.6 DNJ对秀丽隐杆线虫吞咽频率的影响 吞咽频率能够反映秀丽隐杆线虫摄食能力,并且秀丽隐杆线虫寿命可以通过咽泵运动速率来间接进行评价[24]。如图6所示,与对照组相比,10、100 mg/L的DNJ处理组秀丽隐杆线虫吞咽频率极显著增加(p<0.01),与DNJ对秀丽隐杆线虫寿命影响相统一,因此进一步说明10、100 mg/L的DNJ在秀丽隐杆线虫体内发挥一定的抗氧化作用。

图6 不同浓度DNJ对秀丽隐杆线虫吞咽频率的影响Fig.6 Pumping frequency of C.elegans treated with different concentrations of DNJ

2.1.7 DNJ对秀丽隐杆线虫的抗急性热应激效应的影响 综上指标表明,100 mg/L的DNJ对秀丽隐杆线虫的抗氧化作用比较显著,因此热应激仅选用100 mg/L的DNJ对线虫进行处理。文献报道,热应激效应能引起细胞的氧化应激,导致机体组织细胞内氧化代谢产物增加,氧自由基、过氧化物含量增高,抗氧化酶分解氧化物速度很难跟上氧化代谢反应的速度,严重影响了机体正常的生理代谢,发生组织损伤[25],因此100 mg/L的DNJ处理秀丽隐杆线虫,若生长状态越好,则抗氧化能力越强,其抗热应激能力就会越强。如图7所示,与对照组相比,100 mg/L的DNJ组秀丽隐杆线虫生存曲线右移,说明抵抗热应激效应的能力均有所增强,其抗氧化能力明显增强。

图7 100 mg/LDNJ对秀丽隐杆线虫的抗急性热应激效应的影响Fig.7 Heated stress conditions of C.elegans treated with 100 mg/L of DNJ

2.2 基因daf-2和daf-16在DNJ处理秀丽隐杆线虫过程中作用研究

在秀丽隐杆线虫中,daf-2作为胰岛素受体同源物定位于细胞膜上,为线虫中表达胰岛素受体家族的唯一成员。它与胞外类似胰岛素配体结合后,在细胞内产生一系列的信号级联反应,最终通过磷酸化daf-16,而抑制其进入细胞核发挥转录调节功能,延长动物的寿命[26-27]。选用100 mg/L DNJ借助线虫单突变体探究基因daf-2和daf-16在DNJ处理线虫过程中是否发挥作用。

实验结果表明,突变体daf-2和daf-16与自身对照相比,在100 mg/L DNJ处理下,均能延长突变体daf-2和daf-16的寿命(见图8),同时能显著提高其身体弯曲频率(p<0.05，见图10),极显著提高头部摆动频率(见图10)、缩短排泄周期(见图9)、提高吞咽频率(p<0.01,见图11)。突变体daf-2和daf-16在35 ℃热激6 h条件下,100 mg/L DNJ处理能显著提高秀丽隐杆线虫热应激能力,延长寿命(见图12);同时,野生型N2与自身对照相比,在100 mg/L DNJ处理下,也能延长寿命,同时能极显著提高其身体弯曲频率、头部摆动频率、缩短排泄周期(p<0.01，见图1～7);因此突变体与野生型在100 mg/L DNJ处理下,分别与自身对照相比,各表型差异没有显著性(p>0.05,见图8～图13)。因此,一定浓度的1-脱氧野尻霉素在秀丽隐杆线虫体内起到了抗衰老作用,但其作用机制与daf-2和daf-16基因无关。

图9 100 mg/LDNJ对突变体daf-2和daf-16排泄周期的影响Fig.9 Defecation cycle of mutants of daf-2 and daf-16 treated with 100 mg/L of DNJ

图10 100 mg/L DNJ对突变体daf-2和daf-16的运动能力的影响Fig.10 Behavior of mutants of daf-2 and daf-16 treated with 100 mg/L DNJ

图11 100 mg/L DNJ对daf-2和daf-16吞咽频率的影响Fig.11 Pumping frequency of mutants of daf-2 and daf-16 treated with 100 mg/LDNJ

图12 热激条件下100 mg/L DNJ处理对daf-2和daf-16的寿命的影响Fig.12 Lifespan of mutants of daf-2 and daf-16 treated with 100 mg/LDNJ by heating stress

图13 热激条件下100 mg/L DNJ处理的突变体daf-2和daf-16与N2的寿命差异Fig.13 Lifespan differences between mutants of daf-2, daf-16 and N2 treated with DNJ by heating stress

3 结论

本文中秀丽隐杆线虫的寿命、抗氧化酶活力、肠道氧自由基水平等指标,表明DNJ能够提高秀丽隐杆线虫的抗氧化能力,与报道的桑叶DNJ提取物在体外具有良好的抗氧化能力及适量 DNJ可增强小鼠机体抗氧化能力的实验结果基本一致[11-12]。研究报道,daf-2是线虫中表达的胰岛素受体家族的唯一成员,激活daf-16或抑制daf-2是调节胰岛素信号通路延缓秀丽隐杆线虫衰老的关键[28],因此本文通过实验筛选出100 mg/L DNJ浓度后,借助线虫daf-2和daf-16单突变体实验发现daf-2和daf-16基因在DNJ处理线虫过程中并不发挥作用,为进一步证实DNJ对秀丽线虫可能的作用机制,还需进一步对其基因进行后续研究。综上分析,100 mg/L DNJ对秀丽隐杆线虫的抗衰老作用最佳,但其作用机制与daf-2和daf-16基因无关;同时DNJ含量是影响桑叶保健品质的主要指标之一,本实验为桑叶及其他天然植物保健品合适用量的开发利用提供进一步的理论依据。