鲎血细胞蛋白营养学评价及其水解肽体外活性

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(1.广东海洋大学化学与环境学院,广东湛江 524088; 2.广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088)

鲎是地球上古老的生物之一,4亿多年来保持着最原始的样貌,是当之无愧的活化石[1-2]。鲎的含血量大,成年鲎每年大约可以提供600 mL血。1956年,Bang[3]发现细菌能够使鲎血细胞发生凝集,随后Levin等[4]从鲎血细胞里分离纯化出能与内毒素产生凝集反应的活性成分,人们利用这些活性物质制备出鲎试剂,创立了鲎试剂内毒素检测法,运用于检查病人是否被细菌感染,并在药品检验过程中,用来检测放射性药物﹑抗生素类﹑疫苗类等制剂纯度[5-6]。而提取出内容物的血细胞往往被忽略、被废弃,成为研究空白。

据2017年国家统计局最新数据,中国已经处于老龄化社会,60周岁及以上人口24090万,占总人口的17.3%。由于老年人各种细胞器官组织的结构与功能老化,抵抗力下降,发病率增加,而且一个老年病患者往往同时患多种疾病。随着生活水平的提高,生活节奏的加快,我国老年人易患的疾病包括糖尿病[7]和阿尔兹海默病。来源于海洋动物的血细胞蛋白还具有低抗原性、低过敏性等特性,明显优于陆生动物的血细胞蛋白[8-9],是制作保健品的理想原料。为了合理开发利用鲎血细胞蛋白(TTBCP)这种宝贵资源,满足人们对肽制品的需求,本文对TTBCP进行营养学评价,测定其体外抗氧化活性和对α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶抑制活性,以期获得有价值的研究数据证明TTBCP可以用于治疗糖尿病和阿尔兹海默病。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲎血细胞蛋白(TTBCP) 湛江博康海洋生物有限公司;α-葡萄糖苷酶(酶活:300000 U/g)、碘化硫代乙酰胆碱(AICI,纯度>98%,批号:C7H16INOS)、5,5′-二硫代双-2-硝基苯甲酸(DTNB,纯度>99%,批号:C14H8N208S2) 上海金穗生物科技有限公司;乙酰胆碱酯酶(酶活:200 U/g) 上海索莱宝生物科技有限公司;胃蛋白酶(酶活:3800 U/g)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,HPLC 98%)、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG,纯度为99%,批号:K26J8B39810) 上海源叶生物科技有限公司;总抗氧化试剂盒(FRAP法,批号:20170908) 南京建成生物科技有限公司;邻苯三酚(AR) 上海麦克林生化科技有限公司;铁氰化钾(AR) 天津大茂化学试剂厂;H2O2(AR) 天津科密欧化学试剂有限公司;三氯乙酸(AR,纯度>99.0%,批号:20151210) 广东光花科技股份有限公司;Tris-HCl(纯度≥99.0%,批号:EZ1609D313) 塞国生物科技责任有限公司。

DNM-9606酶标分析仪 无锡瑞美生物电子科技有限公司;SPH-100B恒温培养摇床 上海世平实验设备有限公司;UV-5500紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;TF-FD-1台式冷冻干燥机 上海田枫实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 TTBCP中氨基酸的测定 按照GB/T5009.124-2003食品中氨基酸的测定方法,由华南农业大学测试中心完成。

1.2.2 TTBCP的水解方法 TTBCP用胃蛋白酶进行水解,在酶解温度37 ℃﹑酶浓度3%﹑底物浓度4%、pH1.0～2.0条件下,恒温振荡水浴3 h后,3000 r/min离心10 min,取上层清液,冷冻干燥后备用[10]。

1.2.3 氨基酸评分(AAS)方法 根据FAO/WHO 1993年建议的每克氨基酸评分标准模式进行营养价值评定,该模式中,苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸+胱氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和色氨酸分别为:4.0、5.0、3.5、6.0、4.0、7.0、5.5和1.0 g/100 g。氨基酸评分按下式计算:

氨基酸评分(%)=实验蛋白氨基酸含量/(FAO/WHO)评分标准模式氨基酸含量×100

1.2.4 蛋白质效率比(PER) 根据Alesmeyer等[10]提出的方程计算蛋白质的效率比,方程如下:

PER1=-0.684+0.456HLeu-0.47HPro

式(1)

PER2=-0.468+0.454HLeu-0.105HTyr

式(2)

PER3=-1.816+0.435HMet+0.780HLeu+0.211HHis-0.944HTyr

式(3)

式中:HLeu为Leu在蛋白中的质量百分含量;HPro为Pro在蛋白中的百分含量;HTyr为Tyr在蛋白中的质量百分含量;HMet为Met在蛋白中的质量百分含量;HHis为His在蛋白中的质量百分含量。

式中:A空白对照为PBS液+酶液的吸光度;A样品组为样品溶液+酶液的吸光度;A样品对照组为样品溶液+PBS液的吸光度。

1.2.6 对乙酰胆碱酯酶的抑制作用 根据改进的Ellman[12]法,依次加入10 μL的0.6 U/mL乙酰胆碱酯酶液,20 μL不同浓度(浓度分别为0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL)的TTBCP水解液,10 μL 10.0 mmol/L的DTNB和50 μL 0.01 mol/L pH为7的PBS溶液于96孔板中,在37 ℃恒温振荡器中孵化2 min,然后加入10 μL 7.5 mmol/L 的AICI,继续在37 ℃的环境下孵化30 min后测定A415。石杉碱甲作为阳性对照物,其浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL。

式中:A空白对照为PBS液+酶液的吸光度;A样品组为样品溶液+酶液的吸光度;A样品对照组为样品溶液+PBS液的吸光度

1.2.7 总抗氧化能力的测定 20 μL TTBCP水解液(浓度分别为0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL)加入180 μL FRAP工作液混匀,37 ℃恒温振荡器中孵化10 min后测定A593,根据反应后吸光度,计算相应FRAP值[13]。用维生素C作为阳性对照物,其浓度分别为4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL。

式中:空白对照管以纯水代替待测样品;样品对照管以无水乙醇代替DPPH无水乙醇溶液。

式中:空白对照管以纯水代替待测样品;样品对照管以纯水代替过氧化氢溶液。

式中:空白对照管以纯水代替待测样品;样品对照管以纯水代替邻苯三酚溶液。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 TTBCP的氨基酸组成分析

TTBCP的氨基酸组成见表1。从表1可以看出,TTBCP中氨基酸组成全面,其中必需氨基酸模式优于成人的FAO/WHO推荐模式,基本符合小孩FAO/WHO推荐模式(只有亮氨酸含量低于模式值)[17]。谷氨酸的含量最高(10.06 g/100 g),赖氨酸含量(5.81 g/100 g)略高于大豆蛋白(5.5 g/100 g)和大米蛋白(4.0 g/100 g)[18],组氨酸的含量(2.97 g/100 g)高于FAO/WHO模式(1.9 g/100 g)和鸡蛋模式(2.2 g/100 g)[19]。TTBCP中甲硫氨酸和胱氨酸含量较高,表明鲎血中含有丰富的含硫氨基酸,含硫氨基酸可通过自身的抗氧化作用以及合成有重要抗氧化作用的谷胱甘肽来维持机体的氧化还原状态平衡[20];谷氨酸在人体主要是以谷氨酰胺的形式存在,是细胞增殖生长必不可少的物质,能够为嘌呤和嘧啶的合成提供充足的氮源[21];赖氨酸促进人体发育、增强免疫功能,并有提高中枢神经组织功能的作用,充足的赖氨酸摄入是幼儿生长发育的重要保障;组氨酸是幼儿的必需氨基酸,它能促进幼儿的免疫系统尽早完善以及强化生理代谢等[19]。通过氨基酸组成分析可以看出,TTBCP是一种营养价值较高的蛋白。

表1 TTBCP的氨基酸组成Table 1 The amino acid composition of TTBCP

氨基酸根据化学成分的不同分为4类，即非极性氨基酸、极性中性氨基酸、酸性氨基酸和碱性氨基酸。TTBCP的氨基酸分类见表2,从表2可以看出,非极性氨基酸占TTBCP的24.61%,含量最高,酸性氨基酸次之,芳香族氨基酸含量最低,为7.87%。尽管芳香氨基酸含量最低,但仍略高于其在脱脂小麦胚芽(7.6 g/100 g)[22]中的含量。研究表明,非极性氨基酸和芳香氨基酸对多肽的生物活性有重要影响。当非极性氨基酸和芳香族氨基酸出现在多肽的C端时,该多肽具有较强的体外抗氧化活性[23-24]。因此,TTBCP可以用于制备生物活性肽。

2.2 TTBCP的营养学评价

蛋白质中的氨基酸含量特别是必需氨基酸含量是蛋白质营养学评价的重要指标,WHO/UN(1993)建议,高质量的蛋白质其必需氨基酸与总氨基酸的比值(E/T)在36%以上,合理的比值有利于氨基酸的利用,促进蛋白质代谢。从TTBCP的营养评价表3可以看出,TTBCP的E/T为31.2%,略低于WHO/UN的(E/T)在36%以上理想模式,表明TTBCP中的氨基酸的利用率不太高。

表3 TTBCP的营养学评价Table 3 Nutritional evaluation of TTBCP

TTBCP的第一限制性氨基酸是亮氨酸,第二限制性氨基酸是异亮氨酸,第三限制性氨基酸是缬氨酸,除了欠佳的亮氨酸,其他必需氨基酸含量均高于WHO/FAO的小孩建议模式,所以TTBCP主要是限制性必需氨基酸含量的不平衡,就单种必需氨基酸(除了亮氨酸)的含量来说是达到人体需求量。

PER常作为蛋白质吸收利用的评价指标,PER越大其吸收利用越高,当蛋白的PER大于2.0时,表明该蛋白有较高的营养价值[10],TTBCP效率比PER1、PER2和PER3小于2.0,进一步显示其中氨基酸的吸收利用率偏低,生物效价不高。如果补充第一限制性氨基酸亮氨酸含量,平衡TTBCP中各种氨基酸比例,最终将会改善氨基酸利用率,极大提高TTBCP的营养价值。

2.3 TTBCP水解肽对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

图1显示TTBCP水解肽对α-葡萄糖苷酶的抑制活性呈现剂量依赖效应,随着水解肽浓度的增加抑制率逐渐增强,当水解肽浓度为0.8 mg/mL时,抑制率最强达到83.8%,其IC50值为0.199 mg/mL,约为阳性对照阿卡波糖(IC50值为0.024 mg/mL)的十分之一,表明水解肽对α-葡萄糖苷酶有较好的抑制活性,按照α-葡萄糖苷酶的抑制剂的作用机理,水解肽通过口服经转运蛋白运输到小肠,通过与多糖等碳水化合物竞争的方式进而抑制α-葡萄糖苷酶的活性,延缓和阻碍多糖等碳水化合物的消化分解成葡萄糖,最终减少对葡萄糖的吸收[25],达到降血糖、治疗糖尿病的作用。

图1 TTBCP水解肽对α-葡萄糖苷酶的抑制能力Fig.1 Inhibition ability of TTBCP hydrolysate on α-glucosidase

2.4 TTBCP水解肽对乙酰胆碱酯酶的抑制作用

由图2可知,在所设定的水解肽浓度范围内,随着浓度的增加,其对乙酰胆碱酯酶的抑制能力也逐渐增强,呈现正向量效关系,表明水解肽能抑制乙酰胆碱酯酶的活性,但是抑制率不超过38%,不到石杉碱甲抑制率的一半,不适合开发成阿尔兹海默病药物。

图2 TTBCP水解肽对乙酰胆碱酯酶的抑制能力Fig.2 Inhibition ability of TTBCP hydrolysate on acetylcholinesterase

2.5 TTBCP水解肽的抗氧化性分析

2.5.1 水解肽的总抗氧化能力分析 水解肽总抗氧化见图3,由图3可知,水解肽总抗氧化的FRAP值随着水解肽质量浓度的增大而减少,远远小于维生素C的FRAP值。

图3 TTBCP水解肽的总抗氧化能力Fig.3 Total antioxidative capacity of TTBCP hydrolysate

2.5.2 水解肽对DPPH自由基清除能力的影响 水解肽对DPPH自由基的清除能力如图4所示,结果表明,随着浓度的增加,水解肽对DPPH自由基的清除率增加,呈现剂量依赖关系,当质量浓度达到最大值(0.80 mg/mL)时,对DPPH自由基的清除能力也到达最大值,但不到维生素C清除率的一半。

图4 TTBCP水解肽对DPPH自由基的清除能力Fig.4 Scavenging ability of TTBCP hydrolysate against DPPH free radicals

2.5.3 水解肽对羟自由基清除能力影响 水解肽对羟自由基的清除能力如图5所示,水解肽在0.04～0.12 mg/mL浓度范围内呈现剂量依赖效应,随着质量浓度增大而增强,水解肽浓度在0.12 mg/mL时清除率达到最大值,接近维生素C的清除率。在0.12～0.20 mg/mL时清除率有所下降,但仍有较高的清除率。

图5 TTBCP水解肽对羟自由基的清除能力 Fig.5 Scavenging ability of TTBCP hydrolysate against hydroxyl free radicals

2.5.4 水解肽对超氧阴离子自由基清除能力影响 水解肽对超氧阴离子的清除能力如图6所示,较低浓度下,水解肽表现出较好的清除能力,而当浓度增加时,清除能力并没有随着增加。因此,在实验浓度范围内清除率变化不大,采用最低浓度便能获得和最高浓度相当的清除率。

图6 TTBCP水解肽对超氧阴离子的清除能力Fig.6 Scavenging ability of TTBCP hydrolysate

2.5.5 水解肽的体外总还原能力分析 水解肽的还原能力如图7所示。结果表明在0.4 mg/mL时还原能力最强,随着浓度增加,还原能力没有变化,可以确定0.4 mg/mL为最佳使用浓度,在低于0.75 mg/mL浓度时还原能力均比维生素C高。

图7 TTBCP水解肽的还原能力Fig.7 Reducing power of TTBCP hydrolysate

TTBCP水解肽对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)为0.199 mg/mL,抑制率最高达到83.8%,可以产生降血糖效果;因糖尿病以及糖尿病引起的并发症都是跟“氧化应激”有着密切的关系,氧化应激导致胰岛细胞受损﹑肝脏胰岛素抵抗和外周胰岛素抵抗[26],保持体内氧化和抗氧化系统平衡至关重要,特别是中老年糖尿病人容易出现多余的活性氧,有必要食补具有抗氧化活性的物质;另外,药物阿卡波糖会延迟葡萄糖在肠道的吸收[27],糖尿病人吃药过程中需要补充一定的蛋白质增强体能,具有清除超氧阴离子自由基﹑DPPH自由基和羟自由基,甚至当浓度小于0.75 mg/mL的范围时,还原能力大于维生素C的TTBCP是不错的选择。

3 结论

TTBCP中必需氨基酸优于成人的FAO/WHO推荐模式,AAS为68.1,是有营养价值的蛋白质,由于其中亮氨酸所占比例略低,PER小于2.0,影响到TTBCP吸收利用,在食用TTBCP时要适当补充亮氨酸。TTBCP对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)为0.199 mg/mL,抑制率高达83.8%,有望开发成降血糖药物;TTBCP能清除超氧阴离子自由基﹑DPPH自由基和羟自由基,当浓度小于0.75 mg/mL的范围时,还原能力大于维生素C,具有较好的抗氧化活性,能减少氧化应激,有助于糖尿病治疗。由此可见,TTBCP具有复合功效,对糖尿病人来说既可提供营养的优质蛋白,又可作为保健食品和降血糖药物。