桑葚花色苷超高压提取工艺优化及其组分分析

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(1.东北农业大学农学院,黑龙江哈尔滨 150030; 2.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030; 3.黑龙江国际旅行卫生保健中心,黑龙江哈尔滨150090; 4.哈尔滨海关,黑龙江哈尔滨 150028)

桑葚是桑属植物,它是温带、暖温带常见植物,成熟的桑葚营养价值丰富,含有丰富的活性蛋白、维生素、氨基酸、超氧化物歧化酶、白藜芦醇和花青素等备受人们的喜爱[1],其中花青素是水溶性的天然色素,属于黄酮类化合物[2],在植物细胞液中多数以糖苷键形成花色苷而存在,其基本结构单元是C6-C3-C6骨架构成的2-苯基苯并吡喃[3],结构如图1所示。由于苯环上取代基不同形成了近600多种的花色苷,使植物呈现不同的颜色。虽然自然界中花色苷的种类繁多,但存在于植物中的花色苷单体主要有:天竺葵色素、飞燕草色素、矢车菊色素、牵牛花色素、芍药色素和锦葵色素[4],因其独特的结构,使其具有抗氧化活性可清除体内自由基[5]、抗菌消炎[6]、抗肿瘤[7]、保护心脑血管[8]以及缓解视疲劳[9]等功效,现已被广泛应用于食品、药品、化妆品等领域,具有广阔的应用前景。因此,如何高效地从桑葚中提取花色苷已经成为科研工作者研究的热点。

图1 花色苷的基本结构Fig.1 Basic structure of anthocyanins

目前,桑葚花色苷提取主要采用传统热回流提取,该方法萃取得率低,效率低,溶剂消耗量大,在萃取后期,萃取液温度过高会引起热敏性成分发生大量降解[10]。现有一些新型的提取技术用于辅助提取桑葚花色苷,如超声波辅助提取和微波辅助提取技术,这些新技术可以有效改善花色苷的提取效率,但是这两种技术在提取过程中均会引起萃取液温度的升高,局部高温引起花色苷降解的问题无法避免,不适用于热敏性成分的提取。近年来超高压提取技术(High Hydrostatic Pressure,HHP)越来越多的被应用到各种食品加工过程中。超高压提取技术的机理一方面是超高压能够引起带电基团的去质子化,破坏离子键和疏水键,从而导致蛋白质变性和构象发生改变,使桑葚细胞内的花色苷更容易从细胞内扩散到周围溶剂[11]。另一方面细胞膜的通透性增加,根据相变理论,随着压力增加细胞内花色苷的溶解度随之增加[12],因此,超高压处理加快了传质过程,从而有效地提高了花色苷的提取率。对比传统的提取技术,超高压提取技术具有提取时间短、提取效率高、杂质少,节能安全等特点[13]。因此,超高压提取技术被广泛应用于蓝靛果抗氧化物提取[14]、植物多糖提取[15]、茶多酚的提取[16]以及中草药提取[17]。但采用超高压提取技术从桑葚中提取花色苷的工艺以及提取后花色苷单体的种类和含量的研究报道较少。

因此,本文主要从以下两方面开展研究工作:探究压力、保压时间、料液比、乙醇浓度等因素对桑葚花色苷得率的影响,采用响应面方法优化提取工艺参数;采用高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)鉴定桑葚花色苷提取液中花色苷的组分,为桑葚花色苷的深度开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑葚 哈尔滨大润发超市,挑选成熟度一致,颜色鲜艳的桑葚,经除杂清洗置于-18 ℃冰箱中冻藏备用;甲酸、乙腈、甲醇、乙醇 均为色谱纯,美国Fisher公司;超纯水(过0.22 μm滤膜)、盐酸(分析纯) 成都市科龙化工试剂场;香草醛、浓盐酸 天津市富宇精细化工有限公司;飞燕草色素标准品(纯度≥97%)、牵牛花色素标准品(纯度≥99%)、芍药色素标准品(纯度≥98%)、矢车菊色素标准品(纯度≥98%) 美国Chromadex公司;矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品(纯度≥95%) 美国诺威公司。

HPP600 MPa/30 L超高压处理装置 包头科发高压科技有限公司;LAMBDA35型紫外分光光度计 美国Perkin Elmer公司;DK-98-IIA型恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵 巩义仪器有限责任公司;DRYER真空冷冻干燥器 德国西门子公司;安捷伦1100高效液相色谱仪(HPLC) 美国安捷伦有限公司;FZ102微型植物粉粹机 德州润昕实验仪器有限公司植物粉碎机;JYL-Y910九阳打浆机 九阳股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 材料预处理 在实验前,从冰箱中取出桑葚,解冻后打浆,将浆液置于-20 ℃冷冻干燥机干燥48 h,然后用植物粉碎机进行粉碎,过40目筛,制成桑葚果粉,避光密封保存在4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 桑葚花色苷超高压提取 准确称取2.00 g桑葚果粉置于真空包装袋中,按照不同料液比加入不同浓度的乙醇提取液,使其充分混合,封口,将其放入超高压设备中进行提取,设备中的压力迅速升高一定时间后瞬间降压,样品温度固定在30 ℃保持不变,提取结束后,然后将萃取液置于离心机中以4000 r·min-1离心15 min后,将上清液用相同质量分数的乙醇定容到100 mL的容量瓶中,计算出不同提取条件下花色苷的得率。

1.2.3 单因素实验设计

1.2.3.1 提取压力对桑葚花色苷得率的影响 桑葚粉质量为2.00 g,保压时间为6 min,料液比为1∶30 g/mL,乙醇浓度为60%,提取压力分别为100、200、300、400、500 MPa的条件下进行超高压萃取。

1.2.3.2 保压时间对桑葚花色苷得率的影响 桑葚粉质量为2.00 g,提取压力为300 MPa,料液比为1∶30 g/mL,乙醇浓度为60%,保压时间分别为2、4、6、8、10 min的条件下进行超高压萃取。

1.2.3.3 料液比对桑葚花色苷得率的影响 桑葚粉质量为2.00 g,提取压力为300 MPa,保压时间为6 min,乙醇浓度为60%,料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL的条件下进行超高压萃取。

1.2.3.4 提取溶剂乙醇浓度对桑葚花色苷得率的影响 桑葚粉质量为2.00 g,提取压力为300 MPa,保压时间为6 min,料液比为1∶30 g/mL,乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%的条件下进行超高压萃取。

1.2.4 响应面试验设计 在单因素实验的基础上,以提取压力、保压时间、料液比和乙醇浓度为实验因素,以花色苷得率为响应值。根据Box-Behnken实验设计,优化出超高压提取桑葚花色苷的工艺参数。各因素水平及其编码如表1所示。

表1 实验设计因素水平及编码表Table 1 Level of experimental design factors and coding table

采用响应面分析法得到的二次回归模型如下:

式(1)

式(1)中,b0为截距回归系数;bi为线性回归系数;bij为交互项回归系数;Xi,Xj为自变量。

1.2.5 超声波辅助提取和热回流提取桑葚中的花色苷 超声波辅助提取[18]:称取2.00 g桑葚粉末置于100 mL萃取容器中,按照料液比为1∶20,加入85%乙醇将其溶解,然后将萃取容器密封置于超声设备中,设定超声功率为430 W,超声时间为20 min,提取结束后,余下操作同步骤1.2.2。

热回流提取[19]:称取2.00 g桑葚粉末置于200 mL萃取容器中,按照料液比为1∶10 g/mL,加入酸化的乙醇作提取剂,设定提取温度为70 ℃,提取时间为2 h,提取结束后,余下操作同步骤1.2.2。将以上两种提取方法得到的花色苷提取得率与超高压提取进行比较。

1.2.6 桑葚花色苷得率的测定 在50 mL的烧杯中,用1%盐酸-甲醇溶液溶解0.01 g矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品,制成质量浓度为1 g/L的标准溶液。采用pH示差法测定桑葚花色苷得率,其方程如式(2)[20]所示:

Y={[(A520 nm-A700 nm)pH1.0-(A520 nm-A700 nm)pH4.5]×Mw×DF×V×1000}/(Ma×L×m)

式(2)

式(2)中，Y为样品中花色苷得率，mg/g；A为样品提取液的吸光值；DF为稀释倍数；Mw为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量(449.2)；Ma为矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数(26900)；L为比色皿光程，cm；V为总体积，mL；m为样品质量，g。

1.2.7 HPLC法分析桑葚花色苷组成成分

1.2.7.1 花色苷水解 按照NY/T 2640-2014《植物源性食品中花青素的测定》中的HPLC法[21],取最优超高压提取条件下获得的桑葚提取液,加入1 mL浓盐酸,避光,在50 ℃条件下水浴1 h,取出冷却后,用提取液定容至25 mL,经0.45 μm微孔滤膜过滤后用于HPLC分析。

1.2.7.2 花色苷单体标准样的制备 分别精确称取5种桑葚花色苷标准品1 mg,用1%盐酸-甲醇溶液1 mL溶剂使其溶解,然后分别配制成1 mg/mL的母液,取适量花色苷标准品母液进行混合,再用1%盐酸-甲醇溶液依次稀释成200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL测试溶液。以标准品质量浓度X为横坐标,峰面积Y为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.7.3 色谱条件 色谱柱为Waters C18色谱柱(4.6 mm×250.0 mm,5.0 μm),流动相A为1%甲酸水溶液,流动相B为1%甲酸-乙腈溶液,流速为0.80 mL/min,梯度洗脱程序见表2。进样量20 μL,柱温35 ℃,检测波长530 nm。

表2 流动相梯度洗脱条件Table 2 Gradient elution conditions for mobile phase

1.4 数据处理

对每一组数据用SPSS 19.0(SPSS,Inc.,Chicago,US)进行方差分析(ANOVA);采用SAS 8.0(SAS Institute Inc.,NC,USA)分析提取因素水平对花色苷提取效果的显著差异;Design Expert 8.0(SAT-EASE,Inc.,Last September,UK)软件设计组合实验。

2 结果与分析

2.1 单因素对桑葚花色苷提取效果的影响

2.1.1 提取压力对桑葚花色苷提取效果的影响 由图2可知,当提取压力在100～300 MPa时,桑葚花色苷得率随提取压力的增大而显著增加(p<0.05)。其原因一方面是由于高压能破坏离子键和疏水键,使细胞膜上的结构蛋白和构象发生改变,导致细胞膜的通透性增加,进而能有效促进细胞内溶物流出[22]。此外,随着压力的增加细胞能的活性成分的溶解度也随之增加,因此,高压处理能加快传质过程,压力越高越多的活性成分被提取,故升高压力可以提高桑葚花色苷得率。当提取压力在300～500 MPa时,随压力的增大,花色苷的得率基本保持不变,这可能是由于花色苷已经充分溶出且在提取溶剂内溶解已经达到饱和,故增大压力花色苷的得率基本保持不变[23]。过高的压力不仅给提取设备增加负担,也会增加提取成分,综合考虑提取压力选择在200～400 MPa较佳。

图2 压力对花色苷得率的影响Fig.2 Effect of pressure on the yield of anthocyanins注:不同字母表示差异显著(p<0.05),图3～图5同。

2.1.2 保压时间对桑葚花色苷提取效果的影响 由图3可知,当保压时间在2～6 min时,桑葚花色苷得率随保压时间的增大而显著增加(p<0.05),在6 min时,花色苷得率达到最大4.35 mg/g。其原因是由于从保压时间的延长,细胞内的花色苷大量地从细胞内扩散到周围溶剂中,使得花色苷得率显著升高(p<0.05)。在6 min以后,进一步延长保压时间花色苷的得率保持不变。可能是由于提取溶剂中花色苷浓度与桑葚细胞内花色苷一致,内外浓度差趋近于零,即溶剂中花色苷达到饱和状态。因此,进一步延长保压时间,花色苷得率基本保持不变。综合考虑,保压时间选择在4～8 min较佳。

图3 保压时间对花色苷得率的影响Fig.3 Effect of pressure-holding time on the yield of anthocyanins

2.1.3 料液比对桑葚花色苷提取效果的影响 由图4可知,随料液比的增加,花色苷得率呈现先显著增大后显著降低的趋势(p<0.05)。当料液比1∶30 g/mL时,花色苷的得率达到最大值4.21 mg/g。出现这种现象的原因可能是随着料液比的增加,固液接触面积和浓度梯度增加,有利于桑葚细胞内的花色苷由内向外扩散,使得花色苷得率增加[24]。当料液比继续增加,醇溶性的杂质溶解度增加,杂质与花色苷竞争乙醇,使花色苷的溶解被抑制[25]。同时较高的料液比对后续花色苷的分离纯化造成困难。因此,较高的料液比不利于花色苷的提取。综合考虑,料液比选择在1∶20～1∶40 g/mL较佳。

图4 料液比对花色苷得率的影响Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of anthocyanins

2.1.4 乙醇浓度对桑葚花色苷提取效果的影响 由图5可知,桑葚花色苷得率随乙醇浓度的增加呈现先显著增大后显著减小的趋势(p<0.05)。乙醇浓度在60%时,花色苷得率达到最大值4.21 mg/g。其原因是随乙醇浓度的增加,溶剂的溶解解能力增强,促进花色苷溶解,因此花色苷得率随乙醇浓度增大而升高。在乙醇浓度为60%时,其极性与花色苷极性相似,根据相似相容原理,此时花色苷得率最高[26]。当乙醇浓度高于60%,一方面醇溶性的杂质、色素和亲脂性强的成分溶出量增加,其成分与花色苷竞争乙醇-水分子,使得花色苷溶出量降低,进而导致花色苷得率降低[27];另一方面,高浓度的乙醇破坏花色苷-蛋白质和花色苷-纤维素之前的氢键和疏水键[28],破坏花色苷结构。此外,由于极性差距逐渐增大,花色苷溶解度降低,扩散系数减小,故花色苷得率降低[25]。综合考虑,乙醇浓度选择在50%～70%较佳。

图5 乙醇浓度对花色苷得率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on the yield of anthocyanins

2.2 响应曲面法实验结果及方差分析

2.2.1 模型建立与显著性检验 依据单因素实验结果,选取对桑葚花色苷得率影响显著的4个因素即压力(X1)、保压时间(X2)、料液比(X3)和乙醇浓度(X4),根据Box-Behnken实验设计了组合实验对提取工艺进行优化,实验结果如表3所示。运用Design Expert 8.0软件对表3的实验数据进行回归分析,得到桑葚花色苷得率(Y)指标的回归数学模型,剔除不显著项,其回归方程如式(3)所示:

表3 响应曲面法实验设计及结果Table 3 Experimental design and results of response surface methodology

式(3)

对上述的回归方程进行方差分析,结果见表4。

由表3可知,极显著因素为X2,显著因素为X1、X4、X22、X32、X1X2、X2X4,其余因素均不显著。因素对桑葚花色苷提取率影响的主次顺序为X2>X1>X4>X3。结果表明实验因素对响应值不是简单的线性关系,模型中(p<0.001),多元回归关系极显著,相关系数R2=0.8406、模型的变异系数CV=0.1354,失拟项为0.0769(p>0.05),失拟项不显著,说明方程拟合充分,回归方程高度显著,可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系,利用该回归方程可以优化桑葚花色苷最佳提取工艺参数。

2.2.2 桑葚花色苷得率的响应面分析 依据响应曲面得到的回归方程,建立桑葚花色苷得率与实验因素的三维空间的曲面图,确定最佳花色苷得率提取条件。等高线的形状可以反映出交互作用对响应值影响的强弱，如果是椭圆形表明影响显著，如果为圆形表明影响不显著。二次回归方程的响应面及其等高线如图6和图7所示。

图7 乙醇浓度和保压时间对花色苷得率的响应面分析Fig.7 Response surface analysis for the effect of pressure-holding time and ethanol concentration on the yield of anthocyanins

由图6可知，提取压力与保压时间对桑葚花色苷得率的影响较大，曲面陡峭，存在极值，等高线密集，说明两因素的交互作用对该响应值有显著性影响(p<0.05)；由图7可知，乙醇浓度与保压时间对桑葚花色苷得率影响的响应面图曲线陡峭，等高线呈椭圆，说明两因素的交互作用对桑葚花色苷得率的影响显著(p<0.05)。

2.2.3 最佳工艺条件及验证 通过Design Expert软件对式(3)的回归方程分析,得到最佳提取条件:压力269.76 MPa、保压时间6.17 min、料液比1∶35.39 g/mL、乙醇浓度62.16%,桑葚花色苷得率的理论值(4.93±0.12) mg/g,为了验证该方法的可靠性,考虑实际情况,将最佳工艺参数修正为:压力270 MPa、萃取时间6 min、料液比1∶35、乙醇浓度62%,在此条件下进行花色苷得率的验证实验,实验重复3次,平均值为4.81 mg/g,理论值和实验值相对误差为2.43%。说明模型可以较好地模拟和预测桑葚花色苷得率且优化结果具有可行性。

2.3 超高压、热回流、超声波辅助提取三种提取方法对桑葚花色苷效果的比较

由图8可知,超高压提取时间为6 min,花色苷的得率为4.82 mg/g。最优超声波提取条件下,提取时间为20 min,花色苷的得率为3.94 mg/g。最优热回流提取条件下,提取时间为2 h,花色苷的得率为3.57 mg/g。将超高压提取与超声波提取对比发现,前者花色苷的得率提高了18.26%,时间缩短了1.5倍。将超高压提取与热回流提取对比发现,前者花色苷的得率提高了25.93%,时间缩短了4倍。超高压提取能显著提高提取溶剂的渗透速率和活性成分的传质效率,可以在低温下操作,能有效避免热敏性成分因受热而失活,从提取时间、得率方面优于超声波提取和热回流提取。因此,超高压提取技术适合桑葚花色苷的提取。

图8 不同提取方式对花色苷得率的影响Fig.8 Effect of different extraction methods on the yield of anthocyanins

2.4 花色苷提取液的HPLC组分分析

在最优工艺条件下获得的桑葚花色苷的粗提液和4种花色苷单体标准品进行HPLC分析,进一步分析桑葚花色苷单体种类和含量,色谱图如图9所示。分别将4种花色苷单体标准品的质量浓度X与峰面积Y用Sigmaplot软件进行线性回归分析,得到如表5中的标准方程。

表5 5种花色苷标准品曲线、相关系数、线性范围Table 5 Standard curves,correlation coefficients and linear ranges for five anthocyanin standards

图9 4种花色苷单体标准品(a)和桑葚提取液(b)HPLC色谱图Fig.9 Chromatogram of 4 anthocyanin monomer standard(a)and mulberry extracts(b)HPLC

将超高压最优工艺条件下得到的桑葚提取液的色谱图与与标准品色谱图进行比对,并且依据表5中标准品拟合方程,可以定性和定量获得花色苷每个单体含量,其结果如表6所示。

表6 桑葚花色苷出峰时间、质量浓度、含量和比例Table 6 Peak time,mass concentration,and total and individual contents of anthocyanins in mulberry

由图9和表5的出峰时间可以判断,图9b中桑葚花色苷粗提液样品出现4个峰,峰形良好,无杂峰,出峰顺序依次均为飞燕草色素、矢车菊色素、牵牛花色素、芍药色素。超高压最优工艺条件下对应花色苷单体含量分别为1.32、2.05、0.27、0.25 mg/g,花青素总含量为3.89 mg/g。由实验结果可知,桑葚中包含4种花色苷单体,矢车菊色素含量最高,占52.70%,其次是飞燕草色素,占33.93%,牵牛花色素和芍药色素含量差别不大,分别占总花色苷含量的6.94%和6.43%。

3 结论

通过单因素实验,采用响应曲面法优化超高压提取桑葚花色苷的工艺,建立了四因素对花色苷得率的二次回归模型,经验证模型可靠,可用于预测不同提取条件下桑葚花色苷的提取率。根据模型确定最佳的工艺参数为:压力270 MPa、萃取时间6 min、料液比1∶35、乙醇浓度62%,在此条件下桑葚花色苷提取得率为(4.93±0.12) mg/g,较热回流提取和超声波提取得率分别提高了25.93%和18.26%。通过HPLC鉴定出桑葚花色苷包含4种花色苷单体分别为飞燕草色素、矢车菊色素、牵牛花色素、芍药色素,其含量分别为1.32、2.05、0.27、0.25 mg/g。超高压提取技术具有效率高、提取时间短、有效避免热敏性成分因受热而导致的降解和失活,可为桑葚花色苷提取新工艺提供理论依据。