苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法测定麦冬中麦冬多糖含量的比较研究

◎ 张 妍，刘太林

（天津天狮学院，天津 301700）

麦冬 [Ophiopogon japonicas （Thunb.） Ker-Gawl]为百合科沿阶草属多年生植物麦冬的干燥肉质块茎，主要分布于四川、浙江及江苏一带[1-3]。《本草汇言》中记载：麦门冬，味甘、微苦，性微寒，归心、肺、胃经，可为清心润肺之药，常与其他中药配伍，用于治疗肺燥干咳、津伤口渴，心烦失眠、内热消渴以及肠燥便秘等[4]。麦冬的有效成分包括甾体皂苷、多糖、异黄酮和氨基酸等，其中麦冬多糖含量较高，其药理作用主要表现为抗肿瘤、抗心肌缺血、抗氧化、抗过敏、降低血糖、增强机体免疫、润肺平喘并保护外分泌腺等[5-8]。植物多糖的测定方法主要包括苯酚-硫酸法[9-11]、蒽酮-硫酸法[12-14]、还原糖测定法[15-16]、高效液相色谱法[17-18]、酶法[19-20]等，当前文献报道植物多糖测定方法以苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法较为多见。本文分别采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法测定麦冬中麦冬多糖含量，并对测定方法进行比较分析，为确定合理的麦冬多糖含量测定方法提供依据。

1 试验材料

麦冬为市售药材；无水葡萄糖标准品：上海源叶生物科技有限公司（纯度≥98%）；蒽酮：上海国药试剂集团；苯酚、浓硫酸：天津市大茂化学试剂厂（分析纯）；无水乙醇（分析纯）：天津市汇杭化工科技有限公司。

UV-2500型紫外可见分光光度计：岛津仪器有限公司；100～1 000 μL、1 000～5 000 μL移液器：大龙兴创实验仪器有限公司；BSA124S型精密分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；WE-1型水浴恒温振荡器：天津市欧诺仪器仪表有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DH-101-3BS型电热恒温鼓风干燥箱：天津市中环实验电炉有限公司；TD5K-Ⅲ型低速离心机：长沙东旺实验仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 试验溶液的配制

2.1.1 麦冬多糖溶液的制备

麦冬干燥后粉碎过80目筛，精密称取2 g麦冬粉末并加入50倍量纯化水，于70 ℃、振荡频率100 r/min条件下水浴振荡提取2 h，过滤除去药渣后减压浓缩至浓稠，加入8倍量冷无水乙醇静置过夜，离心取下层多糖稠膏，加入适量水溶出并定容至100 mL摇匀，再稀释250倍后摇匀得到麦冬多糖溶液。

2.1.2 葡萄糖标准溶液的制备

精密称取葡萄糖标准品5 mg，用蒸馏水定容至50 mL中，得到0.1 mg/mL标准溶液贮备液。分别量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.8 mL和1.0 mL标准溶液贮备液置于10 mL容量瓶中稀释至刻度线，摇匀，即为浓度10、20、30、40、80 μg/mL和100 μg/mL的葡萄糖标准溶液。

2.1.3 苯酚溶液的制备

称取苯酚100 g，加0.1 g铝片和0.05 g碳酸氢钠常压蒸馏，收集（180±2）℃馏分[13]。精密称取馏分10 g，加蒸馏水定容至100 mL摇匀置于棕色试剂瓶中冰箱保存。

2.1.4 蒽酮-硫酸溶液的制备

精密称取0.5 g蒽酮，溶解于100 mL浓硫酸中，置于棕色试剂瓶中冰箱保存（临用现配）。

2.2 苯酚-硫酸法测定多糖含量

2.2.1 反应产物最大吸收波长的确定

分别精密量取葡萄糖标准溶液与麦冬多糖溶液2 mL置于比色管中，室温下分别加入6%苯酚溶液1 mL摇匀，缓慢加入浓硫酸5 mL，混匀后置于50 ℃条件下水浴显色20 min，流水冷却至室温，在400～700 nm波长区域扫描吸收曲线。

2.2.2 苯酚质量分数的确定

取样品溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸馏水作为空白对照，室温下加入浓度分别为3%、4%、5%、6%和8%苯酚溶液1 mL摇匀，缓慢加入浓硫酸5 mL，混匀后置于50 ℃水浴显色20 min，流水冷却至室温，在490 nm处测定其吸光值，计算多糖含量。

2.2.3 浓硫酸用量的确定

取样品溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸馏水作为空白对照，室温下加入6%苯酚溶液1 mL摇匀，分别缓慢加入浓硫酸4、5、6、8 mL和10 mL，混匀后置于50 ℃条件下水浴显色20 min，流水冷却至室温，在490 nm处测定其吸光值，计算多糖含量。

2.2.4 反应温度的确定

取样品溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸馏水作为空白对照，室温下加入6%苯酚溶液1 mL摇匀，缓慢加入浓硫酸5 mL，混匀后分别置于30、40、50、60 ℃和70 ℃条件下水浴显色20 min，流水冷却至室温，在490 nm处测定其吸光值，计算多糖含量。

2.2.5 反应时间的确定

取样品溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸馏水作为空白对照，室温下加入6%苯酚溶液1 mL摇匀，分别缓慢加入浓硫酸5 mL，混匀后置于50 ℃条件下水浴分别显色10、15、20、25 min和30 min，流水冷却至室温，在490 nm处测定其吸光值，计算多糖含量。

2.2.6 标准曲线的绘制

分别取各浓度的葡萄糖标准溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸馏水作为空白对照，按照上述试验优化得到的最佳试验条件参数，在490 nm处分别依次测定吸光值，绘制标准曲线。

2.2.7 方法学指标的考察

取麦冬多糖溶液，按照上述试验优化得到的最佳试验条件参数，分别依次进行该方法的精密度、稳定性、重现性以及加样回收率的考察。

2.2.8 麦冬多糖含量的测定

取麦冬多糖溶液，按照上述试验优化得到的最佳试验条件参数，测定其吸光值，通过线性回归方程计算麦冬多糖含量。

2.3 蒽酮-硫酸法测定多糖含量

2.3.1 反应产物最大吸收波长的确定

分别精密量取葡萄糖标准溶液与麦冬多糖溶液2 mL置于比色管中，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL摇匀，混匀后沸水浴中显色15 min，迅速置于冰水中冷却，在400～700 nm波长区域扫描吸收曲线。

2.3.2 蒽酮-硫酸溶液用量的确定

取样品溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸馏水作为空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液2、3、4、5 mL和6 mL摇匀，混匀后沸水浴中显色15 min，迅速置于冰水中冷却，在620 nm处测定其吸光值，计算多糖含量。

2.3.3 反应温度的确定

取样品溶液2 mL置于比色管中，以2mL蒸馏水作为空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL摇匀，混匀后分别置于60、70、80、90 ℃和100 ℃水浴中显色15 min，迅速置于冰水中冷却，在620 nm处测定其吸光值，计算多糖含量。

2.3.4 反应时间的确定

取样品溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸馏水作为空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL摇匀，混匀后沸水浴中分别显色10、15、20、25 min和30 min，迅速置于冰水中冷却，在620 nm处测定其吸光值，计算多糖含量。

2.3.5 标准曲线的绘制

分别取各浓度的葡萄糖标准溶液2 mL置于比色管中，以2 mL蒸馏水作为空白对照，按照上述试验优化得到的最佳试验条件参数，在620 nm处分别测定吸光值，绘制标准曲线。

2.3.6 方法学指标的考察

取麦冬多糖溶液，按照上述试验优化得到的最佳试验条件参数，分别进行该方法的精密度、稳定性、重现性以及加样回收率考察。

2.3.7 麦冬多糖含量的测定

取麦冬多糖溶液，按照上述试验优化得到的最佳试验条件参数，测定其吸光值，通过线性回归方程计算麦冬多糖含量。

3 结果与分析

3.1 苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法最大吸收波长的比较

采用两种方法分别对葡萄糖标准溶液和麦冬多糖溶液进行处理，经UV-2500紫外可见分光光度计扫描其在波长400～700 nm区域的最大吸收波长，其波长曲线如图1、图2所示。A曲线表示苯酚-硫酸法，B曲线表示蒽酮-硫酸法。

图1 葡萄糖溶液吸收波长比较图

图2 麦冬多糖溶液吸收波长比较图

由图1和图2可见，采用苯酚-硫酸法测定时，葡萄糖和麦冬多糖在488 nm波长处有明显的最大吸收峰，其余波段无干扰峰，表明麦冬多糖在苯酚-硫酸作用下生成络合衍生物组分单一，显色效果良好。采用蒽酮-硫酸法测定时，葡萄糖和麦冬多糖在400～700 nm波长范围内吸收波长变化较大，在620 nm波长处出现较大吸收峰，但与苯酚-硫酸法相比，最大吸收峰稳定性较差，且存在干扰峰，测定方法准确性不高。

3.2 苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法最佳条件的确定

3.2.1 苯酚-硫酸法最佳条件的确定

苯酚质量分数、浓硫酸用量、反应温度和反应时间对麦冬多糖吸光度值的影响如图3所示。综合考虑，苯酚-硫酸法测定麦冬多糖含量最佳条件为苯酚质量分数 6%、硫酸用量5 mL、反应温度50 ℃、反应时间20 min。

图3 4种因素对吸光度值的影响图

3.2.2 蒽酮-硫酸法最佳条件的确定

蒽酮-浓硫酸溶液用量、反应温度、反应时间对麦冬多糖吸光度值的影响如图4所示。综合考虑，蒽酮-硫酸法测定麦冬多糖含量最佳条件为蒽酮-硫酸用量4 mL、反应温度100 ℃、反应时间15 min。

图4 3种因素对吸光度值的影响图

3.3 苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法标准曲线线性的比较

以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，如图5所示。采用苯酚-硫酸法所得回归方程为y=27.011x-0.0964（R2=0.999 1），在10～100 μg/mL浓度范围内线性关系良好，而采用蒽酮-硫酸法所得回归方程为y=22.929x-0.0513（R2=0.996 4），与苯酚-硫酸法相比，在10～100 μg/mL浓度范围内线性较差。

图5 两种方法测定葡萄糖标准曲线的比较图

3.4 苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法方法学指标的比较

3.4.1 苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法精密度的比较

如表1所示，苯酚-硫酸法测定麦冬多糖的精密度相对标准偏差为1.58%，小于蒽酮-硫酸法的测定结果1.96%，故苯酚-硫酸法的精密度略优于蒽酮-硫酸法。

表1 两种方法测定麦冬多糖精密度的比较表

3.4.2 苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法重复性的比较

如表2所示，苯酚-硫酸法测定麦冬多糖的重复性相对标准偏差为1.90%，明显小于蒽酮-硫酸法的测定结果3.53%，故苯酚-硫酸法的重复性优于蒽酮-硫酸法。

表2 两种方法测定麦冬多糖重复性的比较表

3.4.3 苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法稳定性的比较

如表3所示，在0～120 min内，苯酚-硫酸法测定麦冬多糖的稳定性相对标准偏差为0.46%，略大于蒽酮-硫酸法的测定结果0.34%，故蒽酮-硫酸法稳定性略优于苯酚-硫酸法。

表3 两种方法测定麦冬多糖稳定性的比较表

3.4.4 苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法加样回收率的比较

如表4所示，苯酚-硫酸法测定麦冬多糖的加样回收率为100.63%，优于蒽酮-硫酸法的测定加样回收率101.67%，且其RSD亦优于蒽酮-硫酸法，故苯酚-硫酸法加样回收率优于蒽酮-硫酸法。

表4 两种方法测定麦冬多糖加样回收率的比较表

3.5 苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法测定麦冬多糖含量的比较

如表5所示，苯酚-硫酸法测定麦冬多糖含量为42.96%，其相对标准偏差为1.73%，蒽酮-硫酸法测定麦冬多糖含量为38.56%，其相对标准偏差为3.40%。由此看出，苯酚-硫酸法测定多糖含量高于蒽酮-硫酸法，且相对标准偏差也较小，故苯酚-硫酸法优于蒽酮-硫酸法。

表5 两种方法测定麦冬多糖含量的比较表

4 结论

本研究以麦冬多糖作为研究对象，研究比较两种检测方法对其测定结果的影响，并对两种方法的检测条件进行了优化。苯酚-硫酸法测定麦冬多糖含量最佳条件为苯酚质量分数6%、硫酸用量5 mL、反应温度50 ℃、反应时间20 min，测得麦冬多糖含量为42.96%。蒽酮-硫酸法测定麦冬多糖含量最佳条件为蒽酮-硫酸用量4 mL、反应温度100 ℃、反应时间15 min，测得麦冬多糖含量为38.56%。在葡萄糖浓度10～100 μg/mL范围内，苯酚-硫酸法测定葡萄糖所得标准曲线相关系数（R2=0.999 1）大于蒽酮-硫酸法标准曲线相关系数（R2=0.996 4），说明苯酚-硫酸法制作标准曲线线性关系较好。苯酚-硫酸法测定麦冬多糖精密度RSD为1.58%、重复性RSD为1.90%、0～120 min内稳定性RSD为0.46%、加样回收率为100.63%。蒽酮-硫酸法测定麦冬多糖精密度RSD为1.96%、重复性RSD为3.53%、0～120 min内稳定性RSD为0.34%、加样回收率为101.67%。

结果表明：两种方法均具备操作简单、快速、准确和条件易于控制等优点，均适用于麦冬多糖成分的测定。综合上述实验结果考虑，相对于蒽酮-硫酸法，苯酚-硫酸法更加适用于麦冬多糖含量的测定，且与苯酚-硫酸法相比，蒽酮-硫酸法最大吸收峰稳定性较差，且存在干扰峰，测定方法准确性较差，故在麦冬中麦冬多糖含量测定时可优先考虑苯酚-硫酸法。