大鼠急性心肌梗死后NLRP3炎性体-IL-1β信号轴激活与End-MT的关系*

汤石林， 刘一剑， 彭良善， 赵正亮， 谭一清， 王桥生

(1南华大学附属第一医院重症医学科， 湖南 衡阳 421001； 2长沙市第三医院心内科， 湖南 长沙 410015)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是指在冠状动脉发生病理性变化基础上所引发的冠脉血流急剧减少，从而导致心肌局部持续性缺血坏死，作为心血管领域常见的危重急症之一，严重威胁人类健康。目前，随着冠脉介入、溶栓及搭桥等技术及药物治疗的不断完善，AMI的猝死风险显著降低，但其引发的心力衰竭(heart failure，HF)仍无有效治疗手段。心肌纤维化作为HF晚期病变的共同特征，对其发生机制的深入探讨，将有效改善AMI后HF进程。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性体(inflammasome)作为细胞内模式识别受体的重要组成部分，由NLRP3、接头蛋白 ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain)和pro-caspase-1组成，可被多种内源性和外源性物质激活，包括微生物成分及晶体物质如胆固醇晶体、单钠尿酸盐(monosodium urate,MSU)晶体、硅石等[1]，其激活后促进pro-caspase-1的自我剪切，形成具有活性的caspase-1，活化的caspase-1进一步促进白细胞介素1β前体(pro-interleukin-1β，pro-IL-1β)和白细胞介素18前体(pro-IL-18)水解为成熟的IL-1β和IL-18，从而发挥其对细胞功能的调控，在机体固有免疫系统发挥重要的调节作用[2]。近来研究发现，NLRP3炎性体介导的炎症反应在AMI引发的心肌纤维化过程中发挥重要的调节作用[3]，但其具体机制仍有待进一步研究。

内皮-间充质转化(endothelial-mesenchymal transition，End-MT)是指内皮细胞在受到多种因素的作用下逐步失去其形态和功能，并获得间充质细胞或肌成纤维细胞表型的生物学过程[4]。在AMI大鼠模型中，抑制End-MT过程，心肌纤维化程度得到明显改善[5]，提示End-MT可调节AMI后心肌纤维化的发生发展。研究发现IL-1β作为机体内炎症级联反应的起始因子，在细胞水平促进成纤维细胞生长因子2的持续性产生与激活，后者通过触发细胞内的相关信号通路，促进End-MT[6-7]。然而，在AMI后心肌纤维化过程中，NLRP3炎性体作为IL-1β的主要来源，其持续性激活与End-MT的发生发展是否存在同一性尚未明确。本研究拟在动物水平探讨AMI后心肌纤维化过程中NLRP3炎性体-IL-1β信号轴和End-MT之间的关系，为进一步改善 AMI后心肌纤维化及HF的发生发展提供新的研究思路及治疗靶点。

材 料 和 方 法

1 材料与试剂

10～12周龄雄性SD大鼠购自南华大学医用动物实验中心；羊抗大鼠ASC多克隆抗体和大鼠IL-1β ELISA试剂盒购自Sigma；小鼠抗大鼠CD31单克隆抗体、兔抗大鼠NLRP3多克隆抗体及兔抗大鼠caspase-1多克隆抗体购自Abcam；兔抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和成纤维细胞特异性蛋白1(fibroblast-specific protein 1，FSP1)多克隆抗体购自北京博奥森公司；小鼠抗大鼠GAPDH 单克隆抗体购自爱必信(上海)生物科技有限公司；其它试剂均为进口或国产分析纯。

2 方法

2.1动物模型的构建 30只SD大鼠随机分为假手术对照(sham)组及急性心肌梗死(AMI)组(n=15)。急性心肌梗死组大鼠空腹12 h，称重，固定，备皮，腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉。调整呼吸机参数(呼吸频率45次/分，呼吸比1 ∶1)，测试大鼠疼痛反应，深度麻醉后行气管插管。插管成功后，切开大鼠腹部皮肤(剑突下至左侧腋下)，钝性分离肌肉及肋间肌，暴露心脏，可见心脏搏动，利用手术镊缓慢分离心包膜，暴露心前壁，穿线结扎冠脉左前降支。结扎后肉眼可见心率减慢，结扎区域因缺血呈现苍白色。假手术组按上述手术步骤进行至前降支穿线，不结扎。依次缝合肋间切口、肌肉及皮肤。术后3 d连续肌肉注射青霉素预防感染。

2.2动物取材 28 d后，大鼠空腹12 h，称重，固定，备皮，腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉。深度麻醉后，切开大鼠腹部皮肤，钝性分离肌肉及肋间肌，暴露心脏，将心脏取出并用生理盐水(4 ℃)反复冲洗，直至无积血流出，分离梗死区域，取出一部分进行蛋白提取，剩余部分固定于4%甲醛溶液，行石蜡包埋，切片。

2.3Masson染色 将心肌切片常规脱蜡至水，Weigert苏木素染液染核10 min；蒸馏水充分水洗3次，每次5 min，镜下观察(如过染，用盐酸乙醇分化)；丽春红染液染色10 min；2%冰醋酸水溶液冲洗2 min；1%磷钼酸水溶液分化2 min；苯胺蓝染色液中染色3 min，2%冰醋酸水溶液冲洗2 min；脱水透明，中性树胶封片，镜下观察，拍照。

2.4Western blot实验 将收集好的组织裂解；用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量；加入SDS-PAGE(5×)蛋白上样缓冲液，沸水煮5～8 min，冷却， -20 ℃保存备用。进行SDS-PAGE(80 V， 30 min； 120 V， 90 min)；转膜(200 mA， 2 h)；TBST 封闭液(5%脱脂奶粉)封闭2 h；按比例用TBST配制抗NLRP3、ASC、caspase-1、α-SMA和GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜；TBST洗3次，每次10 min；加入相对应的辣根过氧化物酶标记的 II 抗，室温孵育2 h，TBST 洗3次，每次10 min；免疫印迹荧光检测试剂盒显影检测，采用自动化学发光系统拍摄分析。

2.5ELISA实验 收集组织样品，按试剂盒提供的方法，在含有IL-1β抗体的微孔板中加入100 μL待测样品及标准品，室温孵育2 h；倾除板孔内液体，洗板3次；加入100 μL生物素标记抗体，室温孵育2 h；倾除板孔内液体，洗板3次；加入HRP标记的 II 抗，室温孵育30 min，倾除板孔内液体，洗板3次；加入显色剂，室温孵育15～20 min，终止反应后，测定450 nm处的吸光度(A)值，计算IL-1β浓度。

3 统计学处理

以GraphPad Prism 6.0 软件进行统计分析。所有实验数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 AMI促进心肌纤维化

为进一步验证AMI对心肌纤维化的影响，采用Masson染色检测心肌纤维化水平。结果显示，AMI组心肌纤维化水平明显增加(P<0.05)，见图1。

Figure 1. AMI aggravated myocardial fibrosis. Myocardial fibrosis was detected by Masson staining. Mean±SD. n=15. *P<0.05 vs sham group.

2 AMI促进心肌End-MT

Western blot结果显示，与假手术组相比，AMI显著下调内皮细胞标志物CD31和VE-Cadherin的表达，上调间充质细胞标志物α-SMA和FSP1的表达，见图2。

3 AMI后，NLRP3炎性体-IL-1β信号通路激活与End-MT具有同一性

28 d后采用Western blot检测受损心肌中NLRP3炎性体活性，ELISA检测IL-1β的表达。发现AMI组的NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1及IL-1β的表达明显高于假手术组(P<0.05)，提示在AMI大鼠心肌发生End-MT的同时，NLRP3炎性体-IL-1β信号途径被显著激活，两者进程具有同一性，见图3。

讨 论

AMI作为冠心病的严重类型，常伴有心律失常、HF和心源性休克等一系列并发症，具有较高的发生率及病死率，严重影响患者的生活质量[8]。AMI后，缺血坏死区域纤维化反应明显增加，并累及未受损区域，最终导致HF。我们研究发现，在AMI大鼠模型中，心肌纤维化程度明显增加。因此，控制和改善心肌纤维化进程成为治疗HF的关键靶点。

大量研究证实End-MT与心肌纤维化程度呈正相关，抑制End-MT可显著改善心肌纤维化进程[9-10]。Western blot结果显示，随着AMI大鼠心肌纤维化水平的提高，其内皮细胞正常表型逐渐丢失，并获得间充质细胞表型，End-MT进程加速，但在本研究中并未采用免疫组织化学染色的方法在组织中检测End-MT的变化，存在一定局限性。同时，AMI可导致局部炎症反应增加，持续性的炎症反应又可进一步促进End-MT的发生发展，加速心肌纤维化及HF进程[11]。在AMI大鼠EndMT进展过程中，我们发现NLRP3炎性体及其下游产物caspase-1和IL-1β的表达也被显著上调。NLRP3炎性体介导IL-1β的成熟与分泌作为启动细胞内炎症级联反应的重要环节，在调节AMI后心肌纤维化及重塑过程中发挥关键作用[12]。虽然在AMI 28 d后， NLRP3炎性体激活与EndMT进展具有同一性，其下游产物IL-1β又被证实参与了对End-MT调控因子的调节，但两者的相互作用方式仍有待进一步证实。

本实验研究结果表明在AMI后心肌纤维化过程中，NLRP3炎性体-IL-1β信号轴激活与End-MT的上调同时发生，两者之间的潜在作用将为AMI后HF的防治提供新靶点。

Figure 2.AMI promoted End-MT. The protein expression of CD31, VE-cadherin, α-SMA and FSP1 was determined by Western blot. Mean±SD. n=15. *P<0.05 vs sham group.

Figure 3.AMI activated NLRP3 inflammasome-IL-1β signaling axis. A: the results of Western blot for determining the protein expression of NLRP3, ASC, pro-caspase-1 and caspase-1; B: the level of IL-1β was measured by ELISA. Mean±SD. n=15. *P<0.05 vs sham group.