双盲口线虫ITS rDNA的PCR扩增及序列分析

刘梦婷，李 芬，靳元春，孙淼淼，刘国华,

（1.湖南农业大学动物医学院，长沙 410128；2.中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046）

双盲口线虫（Contracaecum osculatum）是属于异尖科、对盲囊属的一种海鱼线虫，主要寄生于鱼类和海洋哺乳动物，并可传播到人类，引起与幼虫感染或过敏反应有关的胃肠疾病症状[1]。双盲口线虫病是一种海洋自然疫源性疾病[2]。异尖线虫的幼虫可经口感染寄生于人体消化道各部位，亦可引起内脏幼虫移行症，从而使人出现胃肠不适，严重者会突发剧痛伴恶心、腹泻、呕吐等症状，与外科急腹症极为相似[3-4]。研究表明，双盲口线虫三级幼虫具有穿透组织及胃粘膜，引起出血和嗜酸性肉芽肿反应的能力，最重要的是双盲口线虫也具有人畜共患的潜质[5]。因此，迅速而准确的鉴别双盲口线虫具有重要的社会公共卫生意义。

传统寄生虫的分类依据主要包括宿主、传播方式、病原的形态学、致病性、生活史等。由于传统分类方法具有很大主观性，在一些种的鉴定上存在一些争论，尤其在病原形态接近或相似的情况下，用传统分类学对病原进行分类会遇到难以解决的问题[6]。因此，利用现代分子生物技术的发展，直接在遗传物质DNA的核苷酸组成上检测遗传变异成为区分个体间遗传差异最有效的方法之一。核糖体DNA（rDNA）的内转录间隔区（internal transcribed spacers，ITS）中包含的ITS-1及ITS-2序列在生物进化过程中一般显示种的特征，种内具有高度保守性，而在不同种间又有不同程度的变异，是比较理想的种间鉴定的遗传标记，被广泛应用于物种的分类鉴定中[7-8]。

本研究以从波兰大西洋鳕采集到的8条双盲口线虫为研究对象，PCR扩增获得其ITS rDNA序列并进行比较和分析，探索双盲口线虫的ITS rDNA序列能否成为理想的种间遗传标记，从而为双盲口线虫的分类鉴定、分子流行病学调查以及寄生虫病的防治等提供科学依据[9-10]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体样本 采自波兰大西洋鳕体内，样品代码为COSC1、COSC2、COSC3、COSC4、COSC5、COSC6、COSC7及COSC8，保存于75%酒精中备用。

1.1.2 主要试剂和仪器 DNA提取试剂盒WizardTMDNA Clean Up System为Promega公司产品；蛋白酶K为Mereck公司产品；rTaq酶、限制性内切酶EcoRⅠ、DNA Marker DL2000、IPTG和X-gal均为宝生物工程（大连）有限公司产品；凝胶成像分析仪为英国UVItec公司产品；Biometra PCR仪为德国Biometra公司产品；Bio-RAD电泳仪为美国Bio-Rad公司产品；胶回收试剂盒为上海华舜生物工程公司产品。

1.2 方法

1.2.1 虫体DNA提取 从-20℃的酒精保存液中取出单个虫体，置于新鲜灭菌过的1.5 mL离心管中，用蒸馏水反复吹打冲洗3次后，浸泡20 min，吸干表面水分后再反复剪碎。加入275 mL的SDS DNA裂解液（nuclei lysis solution 200 mL、0.5 mol/L EDTA(pH8. 0) 50 mL、4 mg/mL RNase A solution 5 mL、20 mg /mL Proteinase K 20 mL），混匀后，放于微量恒温器中，55℃反应15～18 h，每隔1～2 h 震荡1次。消化完全后，根据Promega 试剂盒的WizardTMDNA Clean-Up System使用说明，提取样品虫体的DNA，置于-20℃中保存。

1.2.2 PCR扩增目的片段 由上海英骏生物技术有限公司合成ITS-1上游引物NC5：5'-GTAGGTGAAC CTGCGGAAGGATCATT-3'，下游引物NC13R：5'-GCTGCGTTCTTCATCGAT-3'；ITS-2上游引物NC5：5'-ATTGCGCCATCGGGTTCATTCC-3'，下游引物NC2：5'-TTAGTT TCTTTTCCTCCGCT-3'。扩增体系25 μ L：10×buffer 2.5 μL、MgCl2(25 mmol/ L)3.0 μL、上下游引物各0.25 μL、rTaq 酶0.25 μL、DNA 样品1 μL，无菌ddH2O补充至25 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃再延伸5 min。同时设置阴性对照组。

1.2.3 扩增片段的克隆和筛选 采用切胶回收的方法对PCR 产物进行纯化，将纯化后的产物连接到pGEM-T Easy载体上，然后转化至感受态细胞JM109中，在含氨苄青霉素和IPTG的LB平板上无菌挑选白色的单菌落进行培养后，菌液PCR鉴定筛选阳性克隆。

1.2.4 测序与分析 经鉴定为阳性的样品送深圳华大基因公司测序，然后将测序结果用DNAStar和Clustalx软件进行序列分析和比较。

2 结果与讨论

2.1 PCR扩增结果PCR产物电泳结果显示，8份样品均成功扩增出大小约为1000 bp的片段，与预期目的片段大小一致（图1），空白对照为阴性，无非特异性条带。

图1 双盲口线虫ITS序列的PCR扩增结果Fig.1 Ampli fication of ITS rDNA from Contracaecum osculatum samples

2.2 DNA测序与序列分析测序后去掉引物，找到ITS-1 rDNA及ITS-2 rDNA序列的头尾，8份双盲口线虫序列（见表1）的ITS rDNA片段大小为885～927 bp，除含有ITS-1 rDNA全序列（441～449 bp）、5.8S rDNA全序列(155 bp) 和ITS-2 rDNA全序列（266 bp）外，还包括18S rDNA和28S rDNA部分序列。判定18S rDNA--ITS-1 rDNA--5.8S rDNA--ITS-2 rDNA-28S rDNA界限系参照GenBank收录的KM273051.1确定。将测得序列与GenBank上公布的双盲口线虫ITS rDNA序列（登录号：KU306718.1）进行比较，相似度为98%～100%，确定8条样品属于双盲口线虫。将样品进行种内对比，发现不同个体间的5.8S rDNA序列无差异，均为155 bp且无差异性，证明5.8S rDNA具有高度保守性；而在ITS-1 rDNA和ITS-2 rDNA的序列中则存在一定差异，分别为0～2.2%和0～3.4%。与其他异尖科线虫的种间差异分析表明，与ITS-1 rDNA差异高于20%，ITS-2 rDNA差异高于35%。从碱基组成来看，8个样品ITS序列的A+T 含量（TS-1：53.45%～54.34%；ITS-2：57.14%～58.65%）稍高于G+C 含量（ITS-1：45.66%～46.55%；ITS-2：41.35%～42.86%）。

表1 双盲口线虫8份样品GenBank序列号Table 1 The GenBank serial number of isolated from samples Contracaecum osculatum

对虫体进行迅速而准确的鉴定分类是寄生虫研究的前提和基础。依靠寄生虫形态学特征为主要标准的传统方法在生物种群的不断进化和发展中逐渐显示出局限性，特别是在针对相似种或近缘种的研究中，仅依靠形态学特征很难完成虫种鉴定。在现代分子生物学研究的推动下，寄生虫的分类鉴定也逐渐向分子水平方向发展[11]。具有功能上的高度保守性和进化的时钟性特点的rDNA序列，已被越来越多地用于物种分类和遗传进化关系的研究，尤其是种间分类研究[11-13]。

PCR技术在寄生虫学领域的应用也日益广泛和深入，寄生虫分子分类学研究的关键是选择合适的靶序列[14]。内转录间隔区ITS是位于rDNA上的区域片段，包括ITS-1 rDNA和ITS-2rDNA两段序列，分别位于18S rDNA-5.8S rDNA和5.8S rDNA-28S rDNA之间。18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA的高度保守性对于PCR扩增非常有利。此外，由于ITS rDNA区域受外界环境因素的影响较小，序列的进化速度较其他区域快，具有高变异性，因而具有种内变异小而种间变异大的特性，是种类鉴定和系统发育分析的重要分子标记[15-16]。研究表明ITS rDNA序列是研究寄生虫分类鉴定及遗传变异的理想标记[10,17]。目前已有许多应用ITS rDNA序列作为线虫种鉴别的分子标记的研究报道[17-20]。

本研究对采自波兰大西洋鳕的双盲口线虫ITS-1 rDNA、ITS-2 rDNA进行PCR扩增，结果发现，不同个体的ITS-1 rDNA和ITS-2 rDNA序列存在很小的种内变异，分别为0～2.2%、0～3.4%。将样品与其他异尖线虫ITS rDNA序列（表2）相比，差异性分别高于20%（ITS-1 rDNA）和35%（ITS-2 rDNA），远远高于其种内差异性（2.2%和3.4%），说明ITS rDNA可以作为种间的遗传变异标记，用于双盲口线虫的分子鉴定。

表2 异尖线虫ITS序列信息Table 2 Representative sequences of ITS sequences of Anisakis spp

本研究结果仅仅基于有限的样品数和单一的基因标记，在进一步的研究中，我们需要收集更多的来自不同地区的双盲口线虫样品，联合多基因标记对其进行更加系统和深入的研究。