利用SRAP检验棉花种子纯度

王桂峰　魏学文　王琰　宋焕

摘要： SRAP是一种新型的基于PCR的标记系统，分别利用SRAP技术和田间种植鉴定方法对对鲁垦棉33号、仁和39号、鲁棉研18号、中植棉2号、鲁棉研36号共5个棉花品种进行纯度的鉴定，结果表明：SRAP鉴定结果与田间种植鉴定结果的一致性较好，利用SRAP标记进行种子纯度鉴定，替代田间种植鉴定，操作简便，鉴定快速经济高效，同时可以克服田间种植鉴定周期长、易受环境影响等缺点。

关键词：棉花种子；纯度；检验；SRAP

中图分类号：S562.091 文献标识码：A 文章编号：2095-3143（2018）04-0002-05

DOI：10.3969/j.issn.2095-3143.2018.04.001

0 引言

种子纯度，作为评价农作物种子质量的最重要指标之一，只有达到相关规定的要求，才能真正发挥品种在产量、品质和抗逆等方面的优良特性。檢验农作物品种种子纯度的方法主要包括大田形态鉴定、生化标记鉴定和分子标记鉴定等三种方法。其中，大田形态标记鉴定所需周期长，存在误差大，且对性状差异小的品种鉴定难度高；生化标记鉴定则受制于组织或器官特异性，存在较大的局限性。棉花种子纯度鉴定技术是业界的一大难题[1-5]。分子标记技术的发展，为品种鉴定提供了新的途径。多种分子标记方法已开始用于品种纯度和真伪的检验，也为棉花种子纯度检验提供了理论和可行方法。为此，项目组引进了相关序列扩增多态性（Sequence Related Amplified Polymorphism，SRAP）技术，开展棉花种子纯度鉴定，为保证棉种质量提供了技术基础。

SRAP是一种新型的基于PCR的标记系统，通过设计一对独特的引物，对基因的开放阅读框（Open reading frames，ORFs）的特定区域进行扩增，该技术由美国加州大学蔬菜作物系Li等于2001年提出[6]。上游引物（Forward primer）长17bp，包括5?端14bp的核心序列和3?端3bp选择性碱基，其中核心序列前10bp为填充序列，无任何特异组成，后接“CCGG”序列特异结合G、C含量丰富的外显子；下游引物（Reverse primer）长18bp，包括5?端15bp的核心序列和3?端3个选择碱基，其中核心序列前11bp为填充序列，接着是“AATT”序列，特异结合A、T含量丰富的启动子和内含子。由于不同个体以及物种的内含子、启动子和间隔序列变异很大，利用该引物对外显子区域、内含子区域和启动子区域进行特异扩增，从而产生多态性。

SRAP技术的引物具有简便、稳定、高效、产率高、易测序、便于克隆目标片段等特点，目前已经广泛应用于小麦、玉米、烟草、花生、萝卜等多种作物的遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建、种质鉴定、重要性状的标记以及相关基因的定位克隆等方面[3，5，7-11]。

本研究从实用的目的出发，利用SRAP技术对棉花品种进行鉴定和种子纯度分析，同时参考田间鉴定结果，为棉花种子纯度鉴定提供一个实用、快速、准确、可行的鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 植物材料与取样方法

试验选用山东省棉花原原种场保存的不同种质资源RM0001～RM0027及繁育较多的鲁垦棉33号、仁和39号、鲁棉研18号、中植棉2号及鲁棉研36号等品种为实验材料。每个品种选取单株的幼叶，液氮速冻，-80℃保存，用于DNA提取。

1.2 DNA提取与PCR扩增

利用CTAB法提取棉花DNA。本实验所有SRAP引物（表1）按照Li等提出的原则设计，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于PCR的Taq酶购自TaKaRa公司。按照试剂盒说明书配制20μlPCR扩增体系，PCR扩增在LabCycler 48（SensoQuest GmbH， G?ttingen， Germany）PCR仪上进行，程序为：94℃变性5 min；94℃变性60 s，35℃退火60 s，72℃延伸60 s，共5个循环；94℃变性60 s，50℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。

1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳

电泳系统采用北京六一电泳仪，扩增产物经6%的非变性聚丙烯胺凝胶电泳检测，180V恒压电泳90 min。

1.4 银染检测

电泳结束后，用蒸馏水稍微冲洗凝胶，按以下方法银染： 10%（V/V）乙醇和0.5%（V/V）冰乙酸固定15 min，；0.2% AgNO3溶液银染20 min；蒸馏水漂洗5s左右，0.002%（wv）硫代硫酸钠的水溶液漂洗2 min；用1% NaOH和0.5%甲醛溶液显色至谱带清晰；0.75%Na2CO3溶液终止显色。之后自来水反复漂洗几次，减少甲醛残留。

1.5 SRAP引物的筛选

用棉花品种RM0001、RM002，对81对引物进行筛选，从而筛选出可用于鉴定不同棉花品种种子纯度的多态性引物。

1.6 遗传多态性分析

用筛选出的引物对RM0001～RM0027以及鲁垦棉33、仁和39、鲁棉研18号、中植棉2及鲁棉研36号进行PCR扩增，并记录扩增情况，按下列公式对各对引物的多态性信息进行统计：引物的多态性比率（%）=多态性条带数/总条带数×100%。

1.7 田间种植鉴定分析

分别于鲁垦棉33号、仁和39号、鲁棉研18号、中植棉2及鲁棉研36号共5个品种的繁育田内随机选取100株，根据个品种的典型性状，对品种植株和杂株进行区分，从而进行田间种植鉴定。

2 结果与分析

2.1 SRAP引物的筛选

利用上文优化的SRAP反应体系，以棉花品种RM0001、RM002筛选81对SRAP引物组合。筛选结果表明，79对SRAP引物扩增出条带，并从79对引物中选择23对条带清晰、稳定性高、重复性好的SRAP引物，对棉花材料进行指纹图谱检测，结果见图1。

2.2 遗传多态性分析

利用23对SRAP引物，以32份棉花材料的DNA为模板进行PCR扩增，不同引物对在不同棉花品种中的扩增结果见表2。结果表明， 152个多态性位点被检测到，多态性位点比例为73.08%，平均每对引物6.9个多态性位点。其中， ME1-EM6和ME3-EM8引物检测到的多态性位点最多，各为10个；ME5-EM4引物检测到的多态性位点最少，为2个。

由于ME1-EM8与ME6-EM6引物对多态性较高，重复性好，稳定性高，能够有效地区分5个棉花品种。因此，本实验采用这2对引物对棉花品种种子纯度进行鉴定分析。

2.3 5种棉花品种纯度鉴定

利用ME1-EM8与ME6-EM6两个引物组合对5种棉花品种进行SRAP纯度鉴定，结果表明，5个种棉花品种的纯度分别为95.311%，97.873%，95.102%，94.799%和95.123%。SRAP纯度鉴定结果与田间种植纯度鉴定结果符合率分别为96.27%，98.86%，98.04%，98.75%和98.06%（表3）。

3 讨论

3.1 关于SRAP扩增谱带的取舍

SRAP扩增产物在基因组中的拷贝数，以及引物及模板的同源性程度均与SRAP扩增条带的强弱有关。所以，SRAP引物作为DNA多态性标记重要的取舍标准是重复性，同时也要兼顾PCR扩增条带的强弱程度。因为如果某一样品模板DNA质量较差，则会造成该样品的PCR扩增条带较弱；如果SRAP引物与模板DNA的匹配程度低，尤其当退火温度升高时，可能会多扩增的稳定性造成影响，从而造成某一个体的大部分带与其它个体强度一致，但仅有一条或少数几条条带较弱的现象。所以，利用SRAP技术对一个扩增位点鉴定分析时，为了提高鉴定的稳定性，需要进行全面的鉴定分析比较。即鉴定时应进行多次重复，选取多态性好、稳定性强的引物对，用于鉴定分析，同时选取稳定性高的条带进行统计记录。

3.2 利用SRAP標记鉴定棉花品种种子纯度的准确性与真实性的影响因素

理论上，SRAP技术是在分子水平上对基因型进行鉴定，其结果可靠、准确。本质上，SRAP技术是PCR扩增反应，因此从采集样品、编号、提取DNA等过程均应做到准确、一致而且无交叉污染，从而保证实验的准确真实。再者，PCR反应条件与PCR结果假阳性也是重要的影响因素，选择高效的Taq酶和适宜的退火温度，可以保证PCR扩增产物的特异性和稳定性。因此，应选择扩增条带简单、退火温度影响不大或对扩增条件不敏感的SRAP引物进行PCR反应。其次，由于影响PCR扩增反应的因素较多，因此需要对不同鉴定材料以及不同品牌的PCR相关试剂进行优化，确保PCR反应体系和程序适宜，从而提高鉴定结果的准确和真实。最后，利用SRAP技术进行种子纯度鉴定时，是对ORFs进行PCR扩增，所以鉴定时使用的引物对越多，鉴定结果的可靠性越高，但成本也随之提高。综上，利用SRAP技术进行种子纯度鉴定时，选择多态性高、稳定性好的SRAP引物对，以便达到鉴定种子纯度的目的。

3.3 利用SRAP标记鉴定棉花品种种子纯度的可行性分析

通过对5种棉花纯度的鉴定表明，SRAP鉴定结果与田间种植鉴定结果的一致性较好，因此，可以选择SRAP标记进行种子鉴定，以替代田间种植鉴定，从而克服其鉴定周期长、易受环境影响等缺点。同时，作物品种种子纯度鉴定，不仅要求简便、快速、准确，还要考虑经济成本因素。在进行种子纯度鉴定时，SRAP技术是通过独特的引物设计对ORFs进行PCR扩增，只需改变引物3′端的3bp的选择性碱基即可得到大量的引物对，且上游引物与下游引物可自由搭配，因此用少量的引物即可获得多种引物组合，具备操作简便，鉴定快速经济高效的特点。

参考文献

[1] 张殿忠. 棉花种子生产环节中的质量控制[J]. 中国农业文摘-农业工程，2017，29（02）：65.

[2] 黄殿成，王飞，刘建功，等. 种子企业应用SSR分子标记鉴定棉花品种真实性和种子纯度[J].中国种业，2015（10）：37-38.

[3] 李家梅. 利用ISSR分子标记技术鉴定棉花的品种真实性和纯度[D]. 合肥：安徽农业大学，2015.

[4] 张西岭，王宝连，张海堂，等. 海南鉴定杂交棉种子纯度价值性分析[J]. 中国棉花，2009，36（08）：18-19.

[5] 王俊芳. 基于SSR标记的棉种真实性和品种纯度鉴定技术研究[D]. 北京：中国农业科学院，2009.

[6] 赵上娟，钟金城，柴志欣，等. 西藏牦牛SRAP遗传多样性及分类进化研究[J]. 生物技术通报，2012（06）：77-82.

[7] 许春梅，柳景兰，张作标. SRAP标记技术在种子纯度鉴定中的研究进展[J]. 中国园艺文摘，2015，31（02）：36.

[8] 熊丽曼，王贤磊，高兴旺，等. 应用SRAP标记鉴定甜瓜种子纯度[J]. 种子，2012，31（02）：9-12.

[9] 刘泽发，孙小武，董亚静. SRAP标记鉴定西瓜种子纯度方法研究[J]. 中国瓜菜，2009，22（01）：5-8.

[10] 王从彦，李晓慧，胡小丽，等. SRAP技术在西瓜种子纯度鉴定中的应用[J]. 河南农业大学学报，2008（05）：491-495.

[11]刘强，高新学，刘铁山等.SRAP技术在水稻品种鉴定和纯度检测中的应用研究[J].山东农业科学，2008（01）：26-28.