艾拉莫德对肺纤维化小鼠肺组织的保护作用

韩 青，房志强，王振华，脱宝经，梁 强，吴振彪，朱 平

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以周身关节增生和侵蚀性滑膜炎为主要病理特征的自身免疫性疾病，最终导致关节畸形和功能丧失，可累及全身多个器官，肺间质病变(interstitial lung disease，ILD)是其常见的并发症。ILD早期无明显症状，故常被患者所忽略，待病变发现后已至晚期而难以治愈，常导致呼吸衰竭甚至死亡[1-2]。艾拉莫德是国家食品药品监督管理局批准的I类新药，是一种甲磺酰胺类非甾体抗炎药[3]。近期的研究显示，艾拉莫德具有抑制滑膜细胞产生炎症因子和B 淋巴细胞的作用，并可促进成骨细胞分化，阻止骨的进一步破坏[2]。体外研究发现，艾拉莫德可以抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的活性，进而抑制炎性细胞因子的生成，如白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，推测艾拉莫德对ILD有一定的抗炎作用，但目前相关研究报道少见[4]。本研究拟通过肺纤维化模型探讨艾拉莫德对ILD的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物与材料

1.1.1 实验动物:健康雌性C57BL/6小鼠40只，鼠龄6～8周，体重20～25 g，购自第四军医大学动物实验中心。实验动物在室温22～24 ℃、湿度55%、日照14 h和黑夜10 h交替条件下饲养，每天早晚各喂料1次，清洗并更换瓶内饮用水。

1.1.2 主要药物、试剂与仪器:艾拉莫德(T-614)(每片25 mg，南京先声制药有限公司生产，批号：090656)研成细末，加质量分数0.9%氯化钠溶液配置成5 mg/ml混悬液；博来霉素针剂，15 mg/支(日本化药株式会社生产)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组:将40只健康雌性C57BL/6小鼠适应性喂养1周后称重标记，使用BLM气管滴注法造模并随机分为对照组和治疗组，每组20只，用苦味酸标记区分每组小鼠。用3.5 mg/kg博来霉素进行气管滴注，使用PBS稀释并统一滴注50 μl。小鼠备皮，使用微量进样器由软骨环中间的位置刺入小鼠气管，缓慢旋动活塞推入相应剂量的BLM，滴注完成后缝合颈部皮肤。之后将小鼠直立旋转，使药物均匀分布在支气管中。造模当天为第0天，治疗组小鼠于造模后第1天开始给予艾拉莫德混悬液50 mg/(kg·d)灌胃治疗，对照组小鼠以同样方法给予PBS 0.2 ml灌胃，均持续 28 d。

1.2.2 小鼠肺组织病理学检测:分别于治疗后第7、14、21及28天采用颈椎脱臼法处死小鼠，每个时间点每组选取5只小鼠，取小鼠部分肺脏组织，剪切成大小为15 mm×15 mm×3 mm的组织块，置于质量分数10%甲醛中固定24 h；标本经洗涤、脱水、透明、浸蜡和包埋后行5 μm厚切片，经苏木精-伊红染色，于光学显微镜下观察肺脏病理学改变并进行炎症评分。0 分为无炎症反应；1 分可见少许炎细胞；2 分为轻度炎症；3 分为中度炎症；4 分者为重度炎症。采用Masson染色观察肺组织纤维化改变；采用Ashcroft评分标准[5]评价模型组小鼠肺组织纤维化情况：0级为正常肺组织；1级肺泡壁或细支气管壁见极细微的纤维性增厚；2级病理变化介于1级和3级之间；3级可见肺泡壁或细支气管壁有中等量纤维性增厚，但无明显肺组织结构破坏；4级病理变化介于3级和5级之间；5级纤维化加重伴随明显的肺组织结构破坏、纤维条索及小的纤维化灶形成；6级病理变化介于5级和7级之间；7级可见肺组织结构严重破坏及大面积纤维化，呈“蜂窝肺”样改变；8级肺组织几乎完全被纤维化组织所占据。所有评分均由两位有经验的病理医师采用双盲法进行界定，以作为评分的最终结果。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组小鼠肺组织病理学表现

治疗第7天两组小鼠肺组织片在光学显微镜下可见血管周围、肺泡内和肺泡间隔内不同程度炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，可见少许浆细胞，部分肺泡腔被破坏或结构消失，两组均有大面积实变区域，对照组小鼠肺组织炎症评分2分，治疗组为1分。治疗第14天可见对照组上述病变持续进展，炎细胞聚集、浸润加重，炎症评分为3分；治疗组小鼠肺泡及间隔病变逐渐恢复，炎细胞减少，炎症评分为2分。治疗第21天，对照组小鼠上述病变未见改善，炎细胞聚集明显，肺组织大面积实变，炎症评分为4分；治疗组小鼠肺泡炎减轻，肺泡结构有不同程度的恢复，炎症评分为2分。治疗第28天，对照组小鼠炎症减轻，炎细胞聚集减少，但实变部位仍大量存在，炎症评分为2分；治疗组小鼠仅有少量肺泡炎症，无其他病变，炎症评分为1分(图1)。

2.2 两组小鼠肺纤维组织病理改变

治疗第7天，两组小鼠肺泡间隔有不同程度的胶原蛋白沉积，甚至出现肺实质大片融合性病变，病变区域及轻度病变区域与正常肺组织混杂分布，呈空间异质性，病变区域主要位于气管和血管周围。治疗第14天，对照组小鼠肺纤维化向肺组织扩展，肺泡结构破坏；治疗组纤维化主要存在于气管和血管周围，间质部分未见改变。治疗第21天，对照组小鼠肺纤维化程度达到高峰，肺组织实变区域有大量纤维化沉积；治疗组小鼠肺纤维化程度逐渐减轻，肺泡结构逐渐正常。治疗第28天，对照组小鼠肺纤维化仍大量存在于气管和血管周围，实变组织仍未恢复；治疗组小鼠肺泡及间隔恢复正常，未见纤维沉积，气管组织弹性纤维染色呈阳性(图2)。Ashcroft纤维化评分显示，治疗后第7天对照组与治疗组小鼠肺组织Ashcroft肺纤维化评分分别为3.5±0.5和2.9±1.0，治疗第14天分别为3.7±0.2和2.7±0.4，差异均无统计学意义(均P>0.05);治疗第21天对照组与治疗组小鼠肺组织Ashcroft肺纤维化评分分别为4.96±0.06和0.70±0.17，治疗第28天分别为4.92±0.10和0.75±0.55，对照组小鼠Ashcroft肺纤维化评分均明显高于治疗组，差异均有统计学意义(均P<0.001)(图3)。

图1 治疗过程中两组小鼠肺组织炎症评分变化(HE ×200)

Fig1 Inflammatory score of mouse lung tissue(HE ×200)

A：治疗第7天对照组炎症评分为2分； B：治疗后第14天对照组炎症评分为3分； C：治疗第21天对照组炎症评分为4分； D：治疗后第28天对照组炎症评分为2分； E：治疗第7天治疗组炎症评分1分； F：治疗第14天治疗组炎症评分为2分； G：治疗第21天治疗组炎症评分为2分； H：治疗第28天治疗组炎症评分为1分

图2 治疗过程中两组小鼠Ashcroft肺纤维化评分变化(Masson×200)

Fig2 Pulmonary fibrosis score during treatment in mice of two groups(Masson×200)

A：治疗后第7天对照组肺纤维化评分为4分； B：治疗第14天对照组肺纤维化评分为5分； C：治疗第21天对照组肺纤维化评分为7分； D：治疗第28天对照组肺纤维化评分为7分；E：治疗后第7天治疗组肺纤维化评分为1分； F：治疗后第14天治疗组肺纤维化评分为2分，较对照组同时期肺纤维化程度减轻； G：治疗后第21天治疗组肺纤维化评分为2分，肺泡结构逐渐正常； H：治疗后第28天治疗组肺纤维化评分为1分

图 3 治疗过程中两组小鼠Ashcroft肺纤维化评分量化比较Fig 3 Comprison of Ashcroft pulmonary fibrosis score between two groups与各自时间点治疗组比较，aP<0.01(独立样本t检验，n=5)

3 讨论

艾拉莫德是一种新型小分子免疫调节剂，结构类似尼美舒利。已有研究发现，艾拉莫德具有多重免疫调节功能[6-7]，能抑制单核细胞NF-κB通路及炎症细胞因子TNF-α转录。Du等[8]研究发现艾拉莫德能够下调IL-17、IL-1、IL-6、IFN-γ等炎症因子水平，具有明显的抗炎作用，并可以抑制关节及软骨的降解；江维等[9]认为艾拉莫德能通过抑制IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子、B淋巴细胞免疫球蛋白IgM及IgG的产生，从而降低炎症反应程度，是一种新型的抗风湿病药物。艾拉莫德最初研发目的在于开发出新型非甾体抗炎药物[10]，随着研究的进展，学者们逐渐发现其免疫调节作用更为突出。同时，Luo等[11]新近研究提示艾拉莫德对IL-17信号通路和小鼠胶原诱导性关节炎均有显著抑制作用。研究提示，艾拉莫德不但对COX-1、COX-2 产生抑制作用，还能对免疫球蛋白、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-17 等产生抑制作用[12]，同时能抑制炎症反应，有减轻骨髓水肿、骨吸收和关节破坏的作用。

本研究结果显示，艾拉莫德可有效减轻BLM诱导的小鼠肺纤维化严重程度，随时间延长效果更为明显，实验小鼠肺组织病理学检查显示，治疗组小鼠在治疗后肺损伤明显改善。有研究表明艾拉莫德可通过抑制脂多糖激活大鼠肺泡巨噬细胞系中的NF-κB减少肺脏的炎性改变[4]，何奕坤等[13]通过肺组织影像学及肺功能研究虽未得出艾拉莫德对于ILD改善的结论，但在治疗过程中没有出现感染或引起ILD进展，说明艾拉莫德在RA和ILD治疗上安全性较好。

本研究说明艾拉莫德对肺脏的损害具有明显的保护作用，能够有效缓解肺纤维化小鼠的病情，可用于肺纤维化的治疗，本研究结果为今后ILD病变的治疗提供了新的治疗选择。本研究团队在后续研究中将重复相关实验，进一步通过在体研究探讨艾拉莫德对B淋巴细胞的作用机制，并在临床开展艾拉莫德治疗ILD的试验和研究，为ILD治疗探索新路径。